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淺談硫酸長春新堿脂質體的釋放度和藥效學研究
【摘要】 目的 考察硫酸長春新堿脂質體的體外釋放度及其藥效。方法 采用pH梯度法制備硫酸長春新堿脂質體，用透析法測定其體外釋放度和血漿釋放度，通過抗小鼠S180腫瘤的抑瘤率評價藥效。結果 硫酸長春新堿脂質體體外釋放度符合零級動力學模型;聚乙二醇單甲醚2000膽固醇琥珀酸酯修飾的硫酸長春新堿脂質體釋放度降低，抑瘤率顯著提高。結論 長循環硫酸長春新堿脂質體降低藥物釋放度，提高藥效。
【關鍵詞】 硫酸長春新堿 脂質體 長循環脂質體 釋放度 藥效學
Abstract:Objective To investigate the release rate and pharmacodynamics in vitro of of vincristine sulfate liposomes. Methods Vincristine sulfate liposomes was prepared by pH gradient method. The release rate was measured by dialysis method. Pharmacodynamics of vincristine sulfate liposomes was evaluated by its antitumor efficacy. Results The release rate of vincristine sulfate liposomes in vitro was fitted to zero?order model. After modification with long?circulating adjuvant, the release rate of vincristine sulfate liposomes decreased and antitumor efficacy increased obviously. Conclusion Long?circulating vincristine sulfate liposomes decrease release rate and increase curative effect.
Key words:vincristine sulfate; liposome; long?circulating liposome; release rate; pharmacodynamics
硫酸長春新堿(vincristine, VCR)為長春花生物堿類抗腫瘤藥物，對白血?⒘馨土鼉哂邢災?钚浴A俅燦τ玫牧蛩岢ご盒錄釵?⑸浼粒?嬖謐乓┪鋨胨テ詼獺⒋?豢�、神�?低澈臀賦Φ藍拘鄖康熱鋇恪S醒芯勘礱鰨??侍遄魑?怪琢鲆┪鐫靨蹇梢愿納埔┪錮砘?災�、提高疗效、綑n拖低澈吞囟ú課唬ㄈ縲腦�、捎z┑畝靖弊饔茫?]。Peter MK等人的研究也表明，硫酸長春新堿制成脂質體能改善藥物體內行為、提高療效、降低毒副作用[2]。因此，抗腫瘤藥物與脂質體結合的處方設計越來越受到關注。
本文采用主動載藥法中的pH梯度法，以氫化大豆卵磷脂/膽固醇(HSPC/Chol)為脂質體膜制備硫酸長春新堿脂質體�？疾炝蛩衢L春新堿脂質體的釋放度和抗小鼠S180腫瘤抑瘤率，同時考察長循環輔料聚乙二醇單甲醚2000膽固醇琥珀酸酯(CHSPEG2000)對釋放度和抑瘤率的影響，以期為該藥臨床應用提供更好的給藥劑型。
1 實驗材料
1.1 試藥
硫酸長春新堿(廣州環葉制藥有限公司)，硫酸長春新堿對照品(中國藥品生物制品鑒定所)，氫化大豆卵磷脂(HSPC，德國)，膽固醇(Chol，藥用，溫州市甌海食品生化廠)，CHSPEG2000 (聚乙二醇單甲醚2000膽固醇琥珀酸酯，自制)，陽離子樹脂(上海樹脂廠)，其他試劑均為分析純。
1.2 儀器
P230高效液相色譜儀(大連依利特)，FC204分析天平(上海精科儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋(大連醫療器械廠)，PHS?25型pH計(上海精科雷磁)，DF?101磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)，透析袋(美國VIKASE公司)，M?110L型微射流儀(美國microfluids公司)。
1.3 動物
小白鼠(18～22 g，沈陽藥科大學實驗動物中心，SCXK 遼2005-008);家兔(2～3 kg，沈陽藥科大學實驗動物中心，SCXK 遼2005—008);S180腫瘤(遼寧省腫瘤研究所)。
2 方法與結果
2.1 pH梯度法制備硫酸長春新堿脂質體及包封率測定[3]
2.1.1 HPLC條件
色譜柱：Kromasil C18(200 mm×4.6 mm,5 μm);流動相：甲醇?水?二乙胺(體積比70∶30∶0.5)(磷酸調pH7.0);柱溫：35 ℃;流速：1.2 mL/min;紫外檢測波長：298 nm。
2.1.2 空白脂質體的制備
將HSPC、Chol按2∶1(質量比)混合，加適量無水乙醇，65 ℃水浴中加熱溶解，揮除乙醇，加枸櫞酸緩沖液(0.3 mol/L，pH 4.30)，65 ℃水化30 min，用微射流儀循環數次，依次通過0.8和0.45 μm的微孔濾膜整粒，得空白脂質體。將HSPC、Chol、CHSPEG2000按2∶1∶0.2(質量比)混合，其他操作同上，得長循環空白脂質體。
2.1.3 硫酸長春新堿脂質體的制備
取空白脂質體0.2 mL、硫酸長春新堿溶液(1.0 g/L)1.0 mL和Na2HPO4溶液(0.375 mol/L;pH 9.0)0.8 mL混勻(pH 7.3)，于60 ℃孵化10 min，得硫酸長春新堿脂質體。取長循環空白脂質體同法操作，得長循環硫酸長春新堿脂質體。
1.4 硫酸長春新堿標準曲線制備
取硫酸長春新堿對照品儲備液(0.1 g/L)，用70%(體積分數)甲醇配制成1.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 mg/L的系列溶液，濾過，HPLC測定;以峰面積(A)對質量濃度(ρ)線性回歸，得回歸方程A=14.5ρ+3.1(r=0.999 9)，線性范圍1.0～12.5 mg/L。
2.1.5 硫酸長春新堿脂質體藥物回收率測定
取0.8，1.0，1.2 g/L的硫酸長春新堿溶液各1 mL，分別加入空白脂質體0.2 mL和Na2HPO4溶液0.8 mL，制備不同濃度硫酸長春新堿脂質體。取各濃度脂質體各0.3 mL分別置于5 mL量瓶中，以去離子水定容，搖勻，再取1.5 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容，搖勻，濾過，HPLC法測定。代入標準曲線計算藥物含量，進而計算回收率。結果表明，硫酸長春新堿脂質體中藥物回收率為 98.1%～101.8%。
2.1.6 硫酸長春新堿脂質體包封率的測定
1.2”中硫酸長春新堿脂質體0.3 mL兩份，一份置5 mL量瓶中，以去離子水定容，再取1.5 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容，混勻，濾過;另一份上陽離子樹脂柱，以去離子水洗脫，收集5 mL洗脫液，再取1.5 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容，混勻，濾過。HPLC測定，計算包封率：包封率=A過柱/A未過柱，其中A過柱表示脂質體包封的硫酸長春新堿的色譜峰面積;A未過柱表示總的硫酸長春新堿的色譜峰面積。
結果表明，硫酸長春新堿脂質體的包封率為86.9%，長循環硫酸長春新堿脂質體包封率提高到92.8%。
2.2 硫酸長春新堿脂質體體外釋放度的考察
2.2.1 分析方法建立
將4 mL空白脂質體裝入預處理好的透析袋中，于37 ℃生理鹽水(100 mL)中透析10 h，取外層透析液用紫外分光光度計于298 nm測定吸光度(λVCR 297.8 nm)，吸收值為零。說明空白脂質體在10 h內未通過透析袋，可采用透析法測定硫酸長春新堿脂質體的體外釋放度。
2.2.2 硫酸長春新堿脂質體體外釋放度的測定
取硫酸長春新堿溶液、硫酸長春新堿脂質體和長循環硫酸長春新堿脂質體各4 mL，分別加入預處理好的透析袋中，再分別置于37 ℃生理鹽水中透析，定時取透析液2 mL，并補加等量生理鹽水。將透析液濾過，測定藥物濃度，計算通過半透膜的藥物累積釋放量Mt，進而計算累積釋放度，結果見圖1。
Mt=cnV0+∑ni=1ci-1V
其中，V0為釋放介質體積,cn為第n次取樣時濃度,V為取樣體積。
圖1 硫酸長春新堿溶液和脂質體累計釋放度 Fig.1 Fractional release of vincristine sulfate liposomes
with different compositions
將硫酸長春新堿脂質體和長循環硫酸長春新堿脂質體中藥物累積釋放度(F)對時間(t)線性擬合，方程分別為F=3.1t+0.9 (r=0.998 5)和F=0.8t+0.7 (r=0.998 0)，表明兩種脂質體均符合零級釋藥模型。由方程斜率可知，CHSPEG2000修飾可降低脂質體中藥物釋放速率，10 h硫酸長春新堿的釋放度由32.43%降低到8.6%。
2.3 硫酸長春新堿脂質體血漿釋放度的考察
2.3.1 硫酸長春新堿水溶液標準曲線制備
取硫酸長春新堿對照品儲備液(1.0 g/L)，用去離子水配制成5.0，12.5，25.0，37.5，50.0 mg/L的系列溶液，各取2 mL于5 mL量瓶中,分別以甲醇定容。HPLC法測定，以峰面積(A)對質量濃度(ρ)進行線性回歸，方程為A=19.0ρ+2.7(r=0.999 6)，線性范圍2.0～20.0 mg/L。
2.3.2 硫酸長春新堿血漿溶液標準曲線制備
取硫酸長春新堿對照品儲備液(1.0 g/L)用血漿配制成5.0，12.5，25.0，37.5，50.0 mg/L的系列溶液，各取2 mL于5 mL量瓶中甲醇定容，混勻，15 000 r/min離心5 min，取上清液過濾進樣，得回歸方程A=18.3ρ+2.3(r=0.998 9)，線性范圍2.0～20.0 mg/L。
2.3.3 血漿中硫酸長春新堿回收率的測定
配制5.0，10.0，15.0 mg/L的硫酸長春新堿血漿溶液，按“2.3.2”方法操作，HPLC測定A，代入水溶液標準曲線，求算藥物濃度，并計算回收率。結果表明，血漿中藥物回收率為97.9%～102.1% 。
2.3.4 陽離子樹脂對血漿中硫酸長春新堿的吸附
配制系列濃度的硫酸長春新堿血漿溶液(40～120 mg/L)，37 ℃水浴孵化10 min，各取1 mL溶液，分別上陽離子樹脂柱，以去離子水洗脫，收集洗脫液，取2 mL置于5 mL量瓶中，以甲醇定容，HPLC法測定。結果表明，過陽離子樹脂的溶液未檢測出硫酸長春新堿，說明陽離子交換樹脂能完全吸附血漿中游離和蛋白結合的硫酸長春新堿，此法可以檢測脂質體的血漿釋放度。
2.3.5 硫酸長春新堿脂質體血漿釋放度的測定
取硫酸長春新堿脂質體和長循環硫酸長春新堿脂質體各4 mL(CVCR 0.5 g/L)，分別與20 mL血漿混勻，37 ℃定時取樣1 mL，上陽離子樹脂柱，以去離子水洗脫，收集洗脫液，取2 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容。HPLC法測定，計算釋放度，結果見圖2。結果表明，硫酸長春新堿脂質體和長循環硫酸長春新堿脂質體在血漿中24 h分別釋放61.5%和51.4%。
2.4 硫酸長春新堿脂質體的藥效學研究
將復蘇的S180細胞接種于小鼠腹腔內，約5 天抽出腹水用生理鹽水稀釋后傳代。將接種S180腫瘤的小鼠隨機分為4組：模型組、硫酸長春新堿溶液組、硫酸長春新堿脂質體組、長循環硫酸長春新堿脂質體組，每組10 只，右側腋下接種(0.2 mL/只)，第3、6、9、12 天尾靜脈注射給藥，第15 天將小鼠拉斷頸椎處死，剝離瘤體稱重。結果表明，各給藥組與模型組比較，差異均有顯著性(P0.01);長循環脂質體組與溶液組比較，差異有顯著性(P0.05)，而脂質體組與溶液組差異則無顯著性，見表1。表1 各組瘤重結果
3 討 論
3.1 脂質體血漿釋放度作為體外檢測手段可以為體內釋放度的預測提供依據。本文采用陽離子樹脂分離血漿中的脂質體和硫酸長春新堿，用HPLC法測定脂質體包封的藥物含量，進而計算硫酸長春新堿脂質體釋放度。結果表明，長循環脂質體比硫酸長春新堿脂質體藥物釋放度低，說明長循環硫酸長春新堿脂質體體內循環時間延長，更有利于發揮藥效。
3.2 藥效學試驗中，用SPSS10.0統計軟件對各組瘤重進行多樣本均數間多重比較。結果表明，各給藥組與模型組比較，差異均有顯著性(P0.01);長循環脂質體組與溶液組比較，差異有顯著性(P0.05)，而脂質體組與溶液組差異則無顯著性。其原因可能是，脂質體靜脈給藥后易被網狀內皮系統細胞，特別是單核吞噬細胞作為外來異物吞噬，且體內成分會導致脂質膜破壞，使藥物滲漏，不能更好發揮藥效;CHSPEG2000修飾的長循環脂質體可以避開單核吞噬細胞的吞噬，使更多藥物到達腫瘤部位發揮療效。因此，長循環硫酸長春新堿脂質體可以明顯提高抑瘤率，增強療效。
3.3 CHSPEG2000為本實驗室合成的一種新型脂質體修飾材料。脂質體形成過程中，CHSPEG2000分子的膽固醇端嵌入脂質體膜中，PEG端向外伸展形成親水層。在體外PEG層可以防止脂質體因融合而造成的藥物滲漏和粒徑增大，并能提高脂質體的包封率;在體內PEG層可以防止脂質體被巨噬細胞吞噬，有助于更好的發揮藥效。
【參考文獻】
[1]LAYTON D, TROUET A. A comparison of the therapeutic effect of free and liposomally encapsulated vincristine in leukemia mice[J]. Eur J Cancer,1980,16: 949.
[2]PETER M K, GRAY M K, GRAY M B, et al. Liposome encapsulated vincristine :preclinical toxicologic and pharmacologic comparison with free vincristine and empty Liposomes in mice, rats and dogs[J].Anti Cancer Drug,1994(5): 579.
[3]趙妍，于彬，鄧意輝，等.主動載藥法制備硫酸長春新堿脂質體及其包封率的測定[J].中國藥學雜志，2005，40(20):1 559.
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