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苯唑西林對金葡球菌ATCC25923青霉素結合蛋白親和力研究
論文關鍵詞 青霉素結合蛋白苯唑西林 親和力
論文摘要 利用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳、熒光放射自顯影術及競爭分析法檢測苯唑西林對金葡球菌ATCC25923青霉素結合蛋白的親和力。結果發現金葡球菌有5條青霉素結合蛋白,即PBP1、PBP2、PBP3、PBP4、PBP5,分子量范圍41~87kD。苯唑西林主要與金葡球菌ATCC25923的PBP1和PBP2親和力強,尤其是與PBP2親和力很強。由此說明金葡球菌的PBP1和PBP2是苯唑西林的主要作用靶位。
青霉素結合蛋白(penicillin-bindingproteins,PBPs)是存在于細菌細胞內膜上一群能同青霉素和其他β-內酰胺類抗生素螯合的細菌蛋白質,即是抗生素作用的靶位點,抗生素與這些靶位點結合后,干擾細菌細胞壁肽聚糖合成而導致細菌細胞溶解死亡。苯唑西林(oxacillin)對金葡球菌具有強大的抗菌作用,對其作用機制的研究,國內未見報道。本文應用微生物生化研究方法,從金葡球菌標準株ATCC25923中提取細菌內膜蛋白,采用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)、熒光放射自顯影術及競爭分析法,研究了苯唑西林與金葡球菌標準株ATCC25923細胞內膜青霉素結合蛋白的親和力,探討苯唑西林殺菌作用的分子學基礎。
1 和方法
1.1 品及試劑
苯唑西林為國家暫行標準品,910u/mg;溶葡萄球菌素(lysostaphin)為Sigma公司產品; -青霉素G鉀,比活性Bq/mmol,英國Amersham同位素公司產品;十二烷基硫酸鈉、聚丙烯酰胺和Triton X-100, 為Sigma公司產品;PPO(2,5-diphenyl-oxa-zol),瑞士Fluka公司產品;二甲基亞砜(DMSO),重慶化學試劑廠產品;X光片為美國Kodak公司產品。
1.2 實驗儀器
超聲粉碎機(Virsonic 300型),美國Vir-tis公司產品;超速低溫離心機Beckman L8-60,美國Beckman公司產品;直立式電泳儀,北京六一儀器廠生產;凝膠吸干器(gel slabdryer),英國Bio-Rad公司產品。
1.3 菌株
金葡球菌標準株ATCC25923,獲自中國科學院菌種保存中心。
1.4 研究方法
1.4.1 增菌
將金葡球菌接種于M-H肉湯(pH7.2)25ml中,37℃恒溫振蕩(速度150~200r/min)孵育16h,再轉移至250ml新鮮預熱的M-H肉湯中繼續振蕩4h。于10℃,8000×g離心10min收集菌體,用50mmol/L PBS(pH7.0)洗滌1次,稱濕菌量可達1~2g。
1.4.2 細菌細胞內膜蛋白質的制備
參照文獻[1]并作改進。將濕菌懸于2倍體積的50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5,含10mmol/L MgCl2、0.14mol/Lβ-巰基乙醇、0.5mg/L DNaseⅠ、300mg/L溶菌酶、25mg/L溶葡萄球菌素),37℃,孵育30~60min,然后在冰浴中進行超聲粉碎(60s破碎+60s間隔,強度14kHz,共6次),在顯微鏡下觀察細胞破裂情況。7000×g,4℃,離心10min去除未破碎細胞。上清液于100000×g,4℃,離心50min使細胞膜沉淀,沉淀物用400~500μl PBS(pH7.0,含1mol/L NaCl,2% Triton X-100,1mmol/Lβ-巰基乙醇)混勻,放0℃30min,于45000×g,4℃,離心35min,上清液(含細菌內膜蛋白)采用Lowry法[2]測定其蛋白質含量,調節蛋白質濃度為10g/L,分裝后放-70℃備用。
1.4.3 苯唑西林與-青霉素G競爭性結合
參照文獻[3]并有改進。在一系列新鮮配制的苯唑西林溶液(0,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2,4,8,32,128mg/L)10μl/管中加入膜蛋白20μl(200μg蛋白質)混勻,37℃,孵育10min,然后加入10μl(3.7×104Bq)14C-青霉素G鉀繼續育10min,最后加入10μl終止緩沖液(3.8%Tris,10%SDS,0.005%溴酚藍,50%甘油(V/V),25%β-巰基乙醇(V/V),pH7.0)終止反應,煮沸5min,待冷卻后作短暫離心,經電泳分離蛋白質。
1.4.4 SDS—PAGE
使用不連續的垂直電泳法,10%分離膠,5%濃縮膠,每孔加樣50μl,電壓75~120V,電流20~30mA,電泳4~6h(即溴酚藍移至距底部約1cm處),凝膠用0.25%考馬斯亮藍R-250染色4h以上,然后用90%甲醇與10%冰乙酸脫色數次。
1.4.5 熒光放射自顯影(Fluorography)
參照文獻[4],將脫色的凝膠浸泡于相當于其20倍體積的二甲基亞砜(DMSO)中,1h后更換新鮮的DMSO再浸泡1h。然后凝膠浸泡于相當其5倍體積的22.2% PPO/DMSO中3h,繼之置凝膠于蒸餾水中浸泡3h及含10%冰乙酸、1%甘油溶液中浸泡45 min。經凝膠干燥器進行真空干燥。將X光片進行預曝光,其目的是校正樣品的放射量與X光片呈現影象的非線性關系。預曝光劑量X線電壓40kV,電流50mA,距光源距離50 cm,曝光時間0.02s,即使X光片影象強度增加0.25左右。干燥的凝膠與經預曝光的X光片緊密接觸,-50℃低溫下曝光50~60d。曝光后的X光片在Kodak X光沖洗機中進行顯影、定影處理。
1.4.6 最低抑菌濃度(MIC)
采用試管二倍稀釋法,37℃,孵育16~18h后觀察結果,以肉眼觀察無細菌生長的最低濃度為MIC。
[1]
2 結果
2.1 苯唑西林對金葡球菌ATCC25923的MIC為0.25mg/L。
2.2 苯唑西林對金葡球菌ATCC25923青霉素結合蛋白的親和力見Fig.1。從圖中可知,金葡球菌標準株內膜蛋白質經熒光放射自顯影后可見5條蛋白質條帶(即5種青霉素結合蛋白PBP1~PBP5),分子量分別約為87、80、75、70和41kD,與國外文獻[5]報道一致。X光片上自顯影象強度反應了抗生素與青霉素結合蛋白的親和力,影象強度越強(即蛋白質條帶黑度越深,親和力越弱,反之,親和力越強。從圖上可見,苯唑西林濃度從0~128mg/L遞增時, PBP1和PBP2尤以PBP2影象強度逐漸減弱,即與抗生素親和力逐漸增加。PBP4在高濃度苯唑西林存在時影象強度減弱。PBP3和PBP5影象強度變化不大。說明金葡球菌PBP1、PBP2尤以PBP2是苯唑西林的主要作用靶位,即是苯唑西林的致死靶位。
Fig.1 Competition of oxacillin for PBPsofS.aureusATCC25923a~k:oxacillin concentrations 0,0.06,0.125, 0.25, 0.5, 1,2,4, 8,32,128mg/L respectively
3 討論
早在20世紀40年代已在形態學和生物化學方面對青霉素作用機制進行了初步探索,證明青霉素特異地干擾細菌細胞壁肽聚糖的生物合成。1965年,Wise和Park[6]對經青霉素處理的金葡球菌進行了細致的生化研究,提供了青霉素抑制細菌細胞壁合成過程中交聯反應的直接證據,提出了青霉素作用機制經典學說。70年代Spratt等[1]將電泳技術與熒光放射自顯影術相結合,建立了青霉素結合蛋白的研究方法。由于青霉素G與所有的青霉素結合蛋白都具有良好的結合,所以目前采用其標記物對PBPs從分子水平上進行探討。
β-內酰胺類抗生素首先同細胞膜上的PBPs結合,這些PBPs具有酶活性,參與細菌細胞壁肽聚糖的合成。肽聚糖主要負責維持細菌細胞壁的完整性,β-內酰胺類抗生素與PBPs結合干擾了PBPs正常的酶功能,使細胞壁正常合成阻斷。不同的β-內酰胺類抗生素與不同的PBPs結合,結合后或引起細菌自溶,或形成球形體,或成絲狀細胞,最終細菌分裂停止而死亡。本研究表明,敏感的金葡球菌有5種PBPs,2種必需的PBPs(PBP1,PBP2)與苯唑西林具有強大的親和力。國外對金葡球菌的PBPs已進行了多方面研究[7,8],金葡球菌的PBP1、PBP2、PBP3是抗生素的主要作用靶位,與β-內酰胺類抗生素具有很高親和力。PBP1可能是原始肽糖轉肽酶(peptidoglycantranspetidase),PBP2是靜止期細胞具有轉肽酶功能,PBP3是一種與分隔有關的轉肽酶,PBP4是一種涉及到轉輔助肽糖交聯的DD-羧肽酶和轉肽酶。由于苯唑西林與金葡球菌的2種致死性的PBPs(PBP1,PBP2)具有很高的親和力,說明苯唑西林對敏感的金葡球菌
具有很強的殺菌作用。因此,在上對于非耐性金葡球菌感染仍可選用苯唑西林等β-內酰胺類抗生素治療。
參考文獻
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2 Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A Let al.Protein measurment with the Folin-phenol rea-gent. J Biol Chem,1951;193:265
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4 Georgopapadakon N H, Liu F Y. Penicillin-binding protein in bacteria. Antimicrob AgentsChemother,1980;18:148
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6 Wise E M, Park J J. Penicillin: its basis site ofaction as an inhibitor of peptide crosslinking reac-tion in cell wall mucopeptide synthesis. Proc NatlAcad Sci USA,1965;54:75
7 Georgopapadakou N H, Dix B A, Mauniz Y R.Possible physiological functions of penicillin-bin-ding proteins inStaphylococcus aureus. Antimi-crob Agents Chemother,1986;29:333
8 Mwyke A W, Ward J R, Hayes M Vet al. A rolein vivo for penicillin-binding protein 4 ofStaphy-lococcus aureus. Eur J Biochem,1981;119:389
[2]
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