青霉素結合蛋白與細菌對-內酰胺抗生素的抗藥性機理

時間：2024-09-15 03:41:22 藥學畢業論文我要投稿

相關推薦

　　【論文關鍵詞】青霉素結合蛋白　金黃色葡萄球菌　綠膿桿菌; 細菌細胞壁　病原菌　點結合　大腸桿菌

　　【論文摘要】β-內酰胺抗生素(如青霉素類和頭孢菌素類等)可以專一性與細菌細胞膜上的靶位點結合,干擾細胞壁肽聚糖合成而導致細胞死亡。由于靶位點能與同位素標記的青霉素G進行共價結合,因此將這些靶位點稱之為青霉素結合蛋白(Penicillin binding pro-teins,PBP’s)。一些革藍氏陰性細菌和少數革藍氏陽性菌能夠產生多種β-內酰胺酶,這些酶可以水解青霉素和頭孢菌素等抗生素,而使細胞具有抵抗這類β-內酰胺抗生素的殺傷能力。已經證明β-內酰胺酶產生與質粒和染色體基因有關。對于不產生β-內酰胺

　　β-內酸胺抗生素(如青霉素類和頭抱菌素類等)可以專一性與細菌細胞膜上的靶位點結合，干擾細胞壁膚聚糖合成而導致細胞死亡。由于靶位點能與同位素標記的青霉素G進行共價結合，因此將這些靶位點稱之為青霉素結合蛋白(penieillinbindsng pro-teins，PBP’s)。一些革藍氏陰性細菌和少數革藍氏陽性菌能夠產生多種β一內酞胺酶，這些酶可以水解青霉素和頭抱菌素等抗生素，而使細胞具有抵抗這類β一內酞胺抗生素的殺傷能力。已經證明β一內酞胺酶產生與質粒和染色體基因有關。對于不產生莊內酞胺酶的細菌而言，獲得刀一內酞胺抗性的能力是通過改變抗生素作用的靶位點，其結果或者減少PBP’5的數量或者降低PBP‘s對物的親和力。這種不依賴刀一內酞胺酶而存在的莊內酞胺抗性廣泛存在于人類病原菌中，而絕大多數這類病原菌是從經過刀一內酞胺藥物治療過的病人中分離出來的，如許多分離到的綠膿桿菌〔1〕、金黃色葡萄球菌〔2-3〕、流感嗜血桿菌(4-5)、肺炎鏈球菌(6-7)、淋球菌臨(8-9)、屎鏈球菌(10-11)等均具有內在的β-內酚胺抗性。由于臨床上越來越多地分離到月耐藥性細菌，對于β一內酞胺抗生素的:使用目困.提出了挑戰，有關細菌對β一內酞胺藥物抗性機理的研究也就越來越多地引起人們的重視，這種研究對發展新一代抗生素更有效地用于臨床治療具有重要意義。本文主要介紹細菌內在的口一內酞胺抗性機理研究進展。

　　一、PBp’S的生物學特性

　　早在1940年Gardner在觀察青霉素G對敏感細菌作用時發現細胞壁是β-內酞胺抗生素最初攻擊的靶位點，因為青霉素G的作用首先是削弱細胞壁的功能。后來進一步證實莊內酸胺抗生素首先與細胞膜上的PBP產S結合，這些PBP’s具有酶活性，參與細菌細胞壁膚聚糖的合成。膚聚糖主要負責維持細菌細胞壁的完整性，生長在低滲中的細菌如該結構破壞會導致細胞死亡。β一內酞胺抗生素與PBP’S結合，干擾了PBP’s的正常酶功能，使細胞壁正常合成阻斷。所有檢測的真細菌種至少含有3種PBP’S，有些含有8一9種。有關PBP侶的命名后面將要介紹。對大腸桿菌的PBP尹S研究得最清楚(12.13.14)。在大腸桿菌中有7種PBP’S，依次為PBPIA、IB產S、2、3、4、5、6。這7個PBP’S分別受控于10個不同的染色體遺傳位點。ponA或mrcA決定PBPIA;ponB或mreB控制IB’S;pbpA或mrdA與

　　PBP2產生有關;pbpB或ftsl編碼PBPs;dacB、dacA、dacC三個遺傳位點分別控制PBP4、5、6。PBPIA分子量92KDa，PBPIB’C由一系列分子量在90KDa范圍的蛋白質組成。PBPIA和IB p在體外兼具有轉葡糖基酶和轉膚基酶活性，這二種酶在細菌細胞壁合成中起重要作用，如果PBPIA和IB;S同時失活則導致細胞快速裂解死亡。PBP2分子量為66KDa，在間隔區(septa)細胞壁合成時具有轉膚基酶活性，PBPZ失活，細胞變成球形體不生長。PBP3的分子量為60KDa，在IBgl隔區橫壁(eross一wall)合成時有轉葡糖基酶或(和)轉膚基酶活性。PBP3突變細胞變成無隔膜的絲狀體。PBP4分子量49KDa，具有次級的轉膚基酶、D、D一竣膚酶或D、D一內膚酶活性，在膚聚糖成熟中起作用。PBP4變性導致細胞不能持續轉膚作用。PBPS和6均具有D、D一狡膚酶活性，目前尚未觀察到對于這二個蛋白質變性引起的細菌生理生化反應。除上述發現的7種PBP’S外，用碘代青霉素衍生物又檢測到一種新的PBP’s，命名為PBPIC，有關大腸桿菌PBPIC的特點及功能還不清楚(15)。

　　同時抑制PBP工A與任何一種PBP]B’S，PBPZ或PBP3均導致生長的大腸桿菌細胞死亡。所有這些高分子量PBP’S均具有體外轉膚基酶活性，除PBP2外，其它均具有轉葡糖基酶活性，很明顯，所有這些PBP’s在大腸桿菌細胞壁或橫壁合成的催化控制中起重要作用，它們是獨立的刀一內酞胺抗生素殺傷靶位點。

　　二、pBP’S分離及純化

　　每個大腸桿菌細胞約含105~104個PBP’S分子，共分成二類，一類為含量豐富的低分子量PBP/s，具有D、D一撥膚酶活性，由于含量豐富，這類PBP’s很容易純化。第二類由一些含量較少的高分子量PBP’S組成，純化比較困難，而且純化的PBP’s在體外常常檢測不到酶活性。

　　早期用〔)青霉素標記敏感細菌時發現，青霉素與細胞膜上少數高親和力PBP’s形成的復合物在2%SDS、酚水溶液或沸水中可以保持穩定，而且既便有過剩的非標記β一內酞胺藥物存在時也不與標記的青霉素發生取代。PBP’s能與青霉素衍生物進行共價結合的特性使得人們能用親和層析方法分離純化這些蛋白質，洗脫劑用經胺，因為經胺是轉膚基作用的受體，用這種方法可以純化活性pBP’S

　　Spratt和Pardee(16)發明一種簡單可重復性技術用于PBP’s分離。首先用〔〕一青霉素標記膜制備物，并使之飽和，然后用離子去污劑使之變性(主要防止青霉素一PBP復合物被酶水解)。用SDS聚丙烯酷胺凝膠電泳分離各PBP產s，根據分子量的遞減或者在SDS一中泳動速率遞增命名為，PBPI、2…n。各種細菌的PBP’s均用此法命名，亞類可用A、B、C等。如PBPI又分為PBP一A、1B和1C。

　　在膜制備過程中有必要保留PBP’s活性。需要說明的是，其它的β一內酞胺抗生素如甲氧西林(methieillim)、頭抱西丁(Cef-oxitin)、氨葦青霉素以及moxalaetan等也可與膜蛋白結合，但所有的β一內酸胺抗生素的靶位點均位于PBP/s之間，尚未發現一種只與上述抗生素結合而不與青霉素結合的膜蛋白。另外實驗表明，在分離PBP’s時，用〔〕一青霉素進行體外標記比〔〕升青霉素專一性更高。

　　三、革藍氏陽性細菌PBP‘S改變與細菌內在β一內酞胺抗性關系

　　一般講，革藍氏陽性細菌細胞壁可自由透過β一內酞胺抗生素，除產生β一內酞胺酶菌株，革藍氏陽性菌一般對青霉素敏感。目前產生β一內酞胺酶的菌株在革藍氏陽性菌中主要是葡萄球菌，幾乎所有的金黃色葡萄球菌都產生β一內酞胺酶。由于葡萄球菌產生β-內酞胺酶，臨床上曾采用甲氧西林取代青霉素，但使用不久就分離到抗甲氧西林的突變株。從英國、美國、意大利、澳大利亞、日本等國分離到的抗甲氧西林金黃色葡萄球菌突變株均發現含有一個共同的但在正常敏感菌株中不存在的PBP，命名為PBP2’ (或PBP2a)(17)，分子量約7sKD。，該蛋白質對廣譜房內酞胺抗生素均具有較低的親和力。該PBPZ‘在SDS一page中位于野生型PBPZ和3之間。

[1]

　　Brown和Reyoolds(18)研究表明，金黃色葡萄球菌表達甲氧西林抗性受生長條件的影響。在較低溫度(30℃)或高滲透壓培養基中抗性增加，在低pH值培養基中抗性降低。菌株13136p一m+在30℃對所有的莊內酞胺抗生素均有抗性，但在40℃則表現正常的敏感型。在30℃培養時，細胞膜中出現大量的PBP2’，而40℃生長的細胞則缺少這種PBP2’。因此，Brown提出，當其它的FBP’s失活后，這種新的低親和力PBP取代了其它PBP’s的功能。PBF2’存在于所有的已檢測的抗甲氧西林菌株中。除在葡萄球菌中觀察到PBP’s改變外，在其它抗性菌株中也發現，如抗鄰氯青霉素(Cloxacillin)枯草芽抱桿菌，相應的PBP2a對該種抗生素的親和力降低。在分離到的青霉素抗性產氣英膜梭菌突變株則降低PBPI對青霉素的親和力。因此，在不同的革藍氏陽性菌中，β一內酞胺抗生素與不同的PBP’s親和力也不同。而有些細菌表達這種內在的β一內酸胺抗性機理要復雜得多。例如肺炎鏈球菌，該菌不產生莊內酸胺酶。用SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳分離肺炎球菌PBP’s時發現敏感型肺炎球菌有5種青霉素結合蛋白PBPla、lb、2a、2b和3。用同樣方法檢測耐青霉素菌株的PBP產s發現相應的PBP’s的生化特性和對青霉素的親和力均有所改變。耐青霉素菌株的PBPla和1b完全喪失與青霉素的親和力，出現一種新的分子量較小的PBPlc。另外耐菌株的2b也被一種新的分子量接近于2a的PBP2a產所代替。為進一步研究PBP’s與抗藥性之間的關系。Zighelboim等〔田分離野生型耐青霉素肺炎球菌8249DNA轉化敏感型肺炎球菌受體菌R6。經多次轉化獲得一系列耐藥水平不同的轉化子，轉化結果說明，菌株8249的高耐藥(對青霉素)特征不能通過一次轉化傳給R6。而需要進行多次轉化才能使R。逐漸獲得較高的抗性性狀。Shoekley等〔20〕以及其它的研究者對肺炎球菌耐藥機理研究也得出相同的結果。目前對于肺炎球菌有多少遺傳因子與抗藥性有關還不清楚，但多重轉化實驗逐步獲得高水平耐藥性轉化子說明野生型菌株8249攜帶有多重突變的遺傳因子，抗藥性是受多基因控制，那么受體菌需要吸收多個DNA分子以滿足細胞獲得高水平抗性的需要。這種需要多次轉化逐步獲得較高的抗性水平的現象在金黃色葡萄球菌中也得到證實(17)。

　　從上述研究不難看出，在革藍氏陽性細菌抗性菌株中新出現的低親和力PBP’s阻止了β內酞胺抗生素對細胞的抑制作用，當其它的PBP’s由于抗生素結合而失去活性時，這些低親和力PBPs可以補償其它PBP’s的功能。另外，在抗性菌株中，相應的PBP’s從高抗生素親和力向低親和力方向改變，肺炎鏈球菌PBP’s改變是說明這類問題最好的例子。

　　四、革藍氏陰性細菌PBP’s改變與細菌內在β一內耽胺抗性關系

　　革藍氏陰性細菌的外膜穿透能力變化較大，一般在奈瑟氏菌中較高，在假單抱菌中較低，而腸道菌處于中間水平。多數革藍氏陰性細菌產生介內酞胺酶，這些酶能水解青霉素類、頭抱菌素類等類抗生素�，F已發現絕大多數腸道菌、25%的流感嗜血桿菌、擬桿菌、假單胞菌、淋球菌、粘膜炎布蘭漢氏球菌均產生莊內酞胺酶。

　　對不產生β-內酞胺酶但具有青霉素抗性的淋球菌分析表明，有6個遺傳位點PenA、mtr、penB、peln、tem、env控制菌株內在的莊內酞胺抗性〔20，“‘’。penA基因專一性決定低水平青霉素抗性，mtl~基因本身除增加對青霉素抗性外還與其它的抗生素抗性有關，tem和pen基因本身沒有可表達的性狀，但轉化實驗證明，這二個基因攜同其它三個基因一道可以提高菌株對青霉素的抗性，env基因突變則削弱青霉素抗性表達。

　　Dougherty等發現，青霉素抗性淋球菌首先降低PBPZ對青霉素的親和力，然后降低PBPI的親和力，降低PBPI的親和力可使菌株獲得較高水平的青霉素抗性，當然這一作用同時受其它基因位點的調節。penA與降低PBP2的親和力有關。

　　從臨床接受呱拉西林(piperaeillin)治療的患者體內分離到的β一內酞胺抗性M型和K型綠膿桿菌，發現PBP’s改變可以增加菌株對戶內酞胺抗性水平。在低水平抗性K型綠膿桿菌中，PBP3或者缺少，或者喪失對青霉素的結合能力。中等水平抗性的M型綠膿桿菌菌株則降低所有的PBPs對青霉素的結合能力。另外，從一起淋球菌暴發流行中分離到帶有penA、mtr、penB以及tet基因突變的菌株，這些菌株除改變相應的PBP’s對青霉素的親和力外，還缺少一種正常的外膜蛋白(22)。

　　對三株具有內在莊內酸胺抗性但不產生β-內酞胺酶的流感嗜血桿菌分析指出，這些抗性菌株的抗藥性是由多重因子決定的，而且細胞通透性改變同時引起外膜蛋白改變，并降低PBP3、6或3、4或4對青霉素的親和力。

[2]

　　在某些革藍氏陰性細菌中，改變一種或多種PBPs兼有影響抗生素穿透外膜的功能。已知在革藍氏陰性細菌中β一內酞胺抗生素進入細胞是通過專一性的porin通道，在大腸桿菌突變株研究中證明，外膜蛋白。nZpC和ompF缺陷會導致菌株的低水平戶內酞胺抗性(24-25)。細菌對于β一內酞胺抗生素的內在抗性機理主要通過細菌細胞的物作用點發生改變，降低或失去抗生素與作用點的結合能力，干擾或阻斷藥物進入細菌細胞。在細菌中廣泛存在著PBP‘s改變導致細菌內在的β一內酸胺抗性現象可以使人們分離純化這些PBPs，研究其生理生化特性及構象改變與抗性的關系，創造新一代能夠與這些改變的PBP’s有效結合的β一內酞胺抗生素類。同時也可以改造現有的抗生素，或采用戶內酞胺抗生素的混合物攻擊不同的PBP’s以達到殺傷細菌的目的。對于那些產生β一內酞胺酶的細菌而言，將莊內酸胺抗生素與莊內酞胺酶抑制劑棍合使用也是解決細菌莊內酞胺抗性問題的一種途徑。

　　為達到有效地殺傷病原菌，一定要控制濫用抗生素的現象，另外根據不同地區病原微生物流行特點使用不同的治療途徑是十分必要的。

參考文獻

〔1〕GodfreyAJetal:AntimierobAgChe-mother19:705，1951

〔2〕J3rvisWRetal:InfeetDis4:651，1985

〔3〕DavillardRetal:MedJAnsti:451.1982

〔4〕MendolmanPMetal:AntimierobAgChemother26:235，1984

〔5〕ParrTRetal:Antim三erobAgChe切ot-her25:747，1984

〔6〕Zighelboim5etal:AntimierobAgCh-emother17:434，1980

〔7〕Miehael5etal:JInfeetD三5153:了8，1986

〔s〕BarbourAG:AntimierobAgChemother19:316，1981

〔9〕DougherthTJetal:Anti扭ierobAgCh·emother18:730，1980

〔10〕FoutanaRAetal:AntimierobAgChe-mother28:675，1985