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全氟辛烷磺酸對大鼠興奮性氨基酸影響
【摘要】 目的 探討全氟辛烷磺酸（PFOS）與大鼠中樞神經系統興奮性氨基酸的時間反應關系。方法 將成年Wistar大鼠隨機分為1個對照組和4個實驗組［25mg/（kg· bw），染毒后2,4,8,24h］；用PFOS對成年Wistar大鼠經口1次染毒；對照組給予等體積的2%吐溫-80溶液。高效液相色譜法（HPLC）測定腦組織中谷氨酸、天冬氨酸、γ-氨基丁酸及甘氨酸含量變化。結果 谷氨酸2,4,8h含量分別為（0.89±0.162），（0.75±0.276），（0.84±0.542）μmol/（g·protein），與對照組（1.30±0.063）μmol/（g·protein）比較，差異有學意義(P＜0.05）。天冬氨酸無顯著變化。甘氨酸8,24h含量分別為（1.24±0.352），（1.09±0.215）μmol/（g·protein），與對照組（1.54±0.120）μmol/（g·protein）比較，差異有統計學意義(P<0.05）。γ-氨基丁酸含量24h為（1.68±0.188）μmol/（g·protein），與對照組（2.03±0.370）μmol/（g·protein）比較，差異有統計學意義(P<0.05）。結論 低劑量PFOS染毒后中樞神經系統出現先抑制后興奮的癥狀可能與興奮性氨基酸的參與有關。
【關鍵詞】 全氟辛烷磺酸
全氟辛烷磺酸（Perfluorooctane sulfonate，PFOS）是近年來引起學者密切關注的新發現的持久性環境有機污染物，具有難溶性、生物蓄積性和沿食物鏈向高位營養級的生物體內富集的作用〔1〕。研究表明,PFOS可引起恒河猴體重減輕、血液多種生理生化指標異常、肝細胞空泡化等改變〔2〕。PFOS的污染已遍及全球生態系統〔3〕。本實驗旨在對低劑量PFOS暴露條件下，大鼠腦組織中的谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸含量的時間變化進行測定，探討PFOS神經毒性作用機制。
1 對象與方法
1?1 試劑與儀器 全氟辛磺酸鉀鹽（瑞士fluka公司），用2%吐溫-80配制。鄰苯二甲醛、氨基酸標準品谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸（美國Sigma公司）。醋酸鉀為分析純，甲醇為色譜純。高效液相色譜儀為HP HEWLETT PACKARD SERIES-1100（日本惠普公司）；C18色譜柱（150mm×4.6mm 5μm）（美國Phenomenex公司）。超聲波細胞粉碎機JY96-ⅡN（寧波新芝生物科技股份有限公司）。
1?2 實驗動物分組及處理 健康成年Wistar大鼠（中國醫科大學動物實驗中心）56只，體重190～220g，雌雄各半。隨機分為5組，1個對照組（2%吐溫-80溶液）和4個實驗組PFOS染毒［25mg/(kg·bw)］，每組8只，經口灌胃染毒1次。染毒2,4,8,24h后采集腦組織，經2%戊巴比妥鈉麻醉后，按設定時間將大鼠頸靜脈放血處死，迅速斷頭，開顱取腦，在冰皿上分離腦組織,分別測定2,4,8和24h大鼠腦組織氨基酸含量。
1?3 樣品制備 將分離的腦組織用預冷的生理鹽水1∶9（w/v）勻漿5min，在冰水浴條件下超聲腦組織，3500r/min，4℃離心20min，取上清100μl用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。另取上清1ml 10000r/min，4℃高速離心20min后，取其上清，以備氨基酸測定。
1?4 考馬斯亮藍法測定腦組織蛋白質含量 稱取10mg小牛血清蛋白，溶于蒸餾水中，分別稀釋配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1mg/L的標準品。分別取100μl待測樣品加入考馬斯亮藍5ml，722分光光度計比色，測定待測樣品中的蛋白質含量以備標定氨基酸。
1.5 鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生高效液相色譜熒光法檢測氨基酸含量 標準液配制：分別用1mol/L 氫氧化鈉溶液配制谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸及γ-氨基丁酸標準品1mmol/L的儲備液，臨時用1mol/L 氫氧化鈉稀釋配制成0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，100μmol/L的標準系列。衍生試劑配制：稱取20mg鄰苯二甲醛，0.5ml β-巰基乙醇溶于0.5ml甲醇中；再加入9ml 0.4mol/L硼酸緩沖液(pH為10.5); 超聲溶解，新鮮配制，避光保存。衍生化反應：在室溫下，吸取氨基酸標準液或樣品液100μl，1mol/L氫氧化鈉溶液100μl，加入鄰苯二甲醛衍生試劑400μl，混勻靜置2min后，進樣30μl。
1?6 色譜條件 色譜柱：C18色譜柱（150mm×4.6mm 5μm），柱溫為28℃。流動相A：0.1mol/L醋酸鉀溶液，pH=5.89。流動相B：HPLC級甲醇。B相梯度洗脫條件：0～10min 10%→25%；12～19min 47%→60%；22～27min 100%→100%，28min 10%，平衡5min，30min結束洗脫。用安捷倫色譜工作站記錄并分析結果，峰面積用外標法定量。熒光檢測器，激發波長250nm，發射波長410nm。
1?7 統計分析 采用SPSS11.5軟件進行方差分析。
2 結果
2?1 行為觀察 PFOS染毒組大鼠在染毒2h后出現活動減緩，少動呆臥，嗜睡，24h后活動恢復正常。對照組未見異常改變。
2?2 色譜行為 在上述色譜條件下，標準液及大鼠腦組織中的谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸均得到良好分離。
2.3 不同PFOS急性染毒時間腦組織氨基酸含量變化比較（表1）
表1 PFOS暴露時間大鼠腦組織氨基酸含量的比較（略）
注：與對照組比較,* P<0.05
不同實驗組的天冬氨酸含量無明顯變化；谷氨酸含量在2,4,8h組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；4h組含量降至最低后逐漸升高，24h已恢復正常。而抑制性氨基酸甘氨酸含量8,24h組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；γ-氨基丁酸24h組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。
3 討論
天冬氨酸與谷氨酸是中樞神經系統主要的興奮性神經遞質，其釋放增加可導致神經興奮性或神經毒性作用增強。γ-氨基丁酸、甘氨酸被認為是重要的抑制性神經遞質，具有降低中樞神經系統的興奮性從而起到保護作用。實驗結果顯示，本實驗建立的色譜條件下，標準品和待測樣品中的4種氨基酸均得到良好分離。大鼠經低劑量的PFOS染毒后，γ-氨基丁酸、甘氨酸的含量緩慢降低，同時天冬氨酸與谷氨酸含量先降低后恢復，使大鼠行為表現為嗜睡、行動遲緩，與報道有所不同〔4〕，可能是染毒劑量不同所致。腦組織中興奮性氨基酸總量的下降可能是與PFOS抑制興奮性氨基酸的合成以及降解增加有關。谷氨酸反應迅速，持續時間短，恢復快，2h就開始降低，8h后逐漸升高，24h已恢復至正常水平。而γ-氨基丁酸、甘氨酸的作用緩慢，持續時間長可能是由于機體的負反饋調節機制作用所致，使PFOS對大鼠中樞神經系統的作用在24h內恢復。這種變化的具體機制以及神經系統中重要的信使兼遞質分子一氧化氮、氧自由基、神經營養因子等是否參與PFOS的神經毒性機制有待進一步研究。
【參考文獻】
〔1〕 Tomy GT,Budakowski W,Halldorson T,et al.Fluorinated organic compounds in an eastern Arctic marine food web［J］.Environ Sci Technol,2004,38(24):647-681.
〔2〕 Seacat AM,Thomford PJ,Hansen KJ，et al.Subchronic toxicity studies on perfluorooctanesulfonate potassium salt in cynomolgus monkeys［J］.Toxicol Sci,2002 ,68(1):249-264.
〔3〕 Giesy JP,Kannan K.Global distribution of perfluorooctane sulfonate in wildlife［J］.Environ Sci Technol,2001,35:1339-1342.
〔4〕 李瑩，金一和.全氟辛磺酸對大鼠中樞神經系統谷氨酸含量的影響［J］.衛生毒理學雜志，2004,18(20):232-234.
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