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      2. 氟西汀對海馬神經(jīng)元生長的影響

        時間:2024-09-19 02:42:04 醫(yī)學(xué)畢業(yè)論文 我要投稿
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        氟西汀對海馬神經(jīng)元生長的影響

        氟西汀對海馬神經(jīng)元生長的影響

        【關(guān)鍵詞】 氟西汀;細(xì)胞培養(yǎng);海馬神經(jīng)元;大鼠

          氟西汀是5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑之一,是應(yīng)用較廣的抗抑郁藥。氟西汀除有抗抑郁作用外,尚可治療其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。有研究表明,氟西汀對海馬的神經(jīng)保護(hù)作用是其發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)的機(jī)制之 一[1]。關(guān)于氟西汀對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長的影響未見報道,本研究初步探討了氟西汀對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長的影響。

          1 材料與方法

          1.1 新生大鼠海馬神經(jīng)元的分離和培養(yǎng)

          技術(shù)方法在參考文獻(xiàn)[2]基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。取出生24 h內(nèi)的新生SD大鼠(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供),無菌分離出雙側(cè)海馬,用顯微剪剪碎,D-Hank's液清洗2或3次,將剪碎的海馬組織轉(zhuǎn)移至離 心管中,加入等量0.25%的胰酶(美國Sigma公司),37 ℃消化30 min,中間振搖1或2次,加入10%的 DMEM/F12(美國Gibco公司)5 ml,輕輕吹打15次,然后1 000 r · min-1離心5 min,制成單細(xì)胞懸液,置于CO2 培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司產(chǎn)品)中,差速貼壁30min,去除成纖維細(xì)胞,吸取未貼壁的細(xì)胞,并用200目 的不銹鋼濾網(wǎng)過濾,收集過濾后的單細(xì)胞懸液于培養(yǎng)皿中,然后至離心管中,取一滴單細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù),并用DMEM/F12將細(xì)胞密度調(diào)到1×106ml-1,然后接種于200 μg·ml-1多聚賴氨酸(美國Sigma公司)包被的6孔培養(yǎng)板中,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),4 h后換為 無血清培養(yǎng)基,即含2% B27的Neurobasl培養(yǎng)基(美國Gibco公司),以后每3天半量換液1次。使用培養(yǎng) 6 d的神經(jīng)元進(jìn)行染色鑒定。

          1.2 大鼠海馬神經(jīng)元的鑒定

          1.2.1 醇化酶(NSE)免疫細(xì)胞化學(xué)染色

          取培養(yǎng)6 d 6孔培養(yǎng)板中的蓋玻片進(jìn)行神經(jīng)元特異的NSE免 疫組織化學(xué)染色。棄去培養(yǎng)液,4%多聚甲醛室溫固定1 h ,加入 0.3% H2O2甲醇去除內(nèi)源性過氧化氫酶,0.1% TritonX-100破膜,10%綿羊血清封閉,加入一抗1∶200 兔抗鼠 NSE抗體,4 ℃濕盒過夜,0.01 mmol ·L-1PBS清洗,加入二抗1∶200生物素化的山羊抗兔IgG,放入 37 ℃溫箱孵育 60 min;0.01 mmol · L-1 PBS 清洗,滴加SABC過氧化物酶復(fù)合物,37 ℃溫箱中孵育 60 min,0.01 mmol · L-1PBS清洗,滴加 DAB顯色液作用3~10 min,自來水沖洗后,常規(guī)脫水,透明封片。光鏡下觀察NSE表達(dá)陽性細(xì)胞。

          1.2.2 尼氏染色

          6孔培養(yǎng)板的細(xì)胞培養(yǎng)7d時,取出蓋玻片進(jìn)行尼氏染色。棄去培養(yǎng)液,0.01 mmol · L-1PBS清洗,4%多聚甲醛室溫固定1 h,0.01 mmol · L-1PBS清洗 3次,氯仿中1 min,95%、70%乙醇各1 min, 蒸餾水清洗,置于1%甲苯胺藍(lán)染液中染色20 min,95%乙醇分化,在顯微鏡下觀察控制,時間以尼氏體顯示清晰為準(zhǔn),37 ℃干燥,二甲苯透明,中性樹脂封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。

          1.3 實(shí)驗(yàn)分組

          在培養(yǎng)的第3天加入氟西汀(常州第四制藥廠生產(chǎn)),根據(jù)藥物濃度不同,將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為5組,分別加 入1、10、20、40 μmol · L-1氟西汀;正常對照組加入等體 積的培養(yǎng)基。

          1.4 海馬細(xì)胞形態(tài)定量分析

          倒置相差顯微鏡(德國Zeiss公司產(chǎn)品)下觀察加 藥48 h后的海馬神經(jīng)元形態(tài),每組各孔隨機(jī)選擇20個視野(每個視野0.17 mm2),記錄每個視野內(nèi)細(xì)胞長出突起的神經(jīng)元數(shù)目,目鏡測微尺隨機(jī)測量15個神經(jīng)元突起的長度和胞體的長徑。

          1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

          應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,各項(xiàng)檢測結(jié)果以x-±s 表示。多組比較及組間兩兩比較采用方差分析。

          2 結(jié) 果

          2.1 海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察

          倒置相差顯微鏡下觀察,培養(yǎng)1 d,細(xì)胞絕大部分貼壁,細(xì)胞形態(tài)大小不一,以單突起的小細(xì)胞為主。培 養(yǎng)6 d,神經(jīng)元胞體較大,突起進(jìn)一步增多、延長,并形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)(圖1)。培養(yǎng)12 d,神經(jīng)元胞體進(jìn)一步增 大,突起形成比較稠密的網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)24 d,神經(jīng)元胞體出現(xiàn)空泡,部分神經(jīng)元死亡,胞體崩解,突觸斷裂。

          2.2 海馬神經(jīng)元鑒定

          NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色:染色后光鏡下觀察第6 天的神經(jīng)細(xì)胞,胞漿和突起被染成棕黃色為NSE抗體 表達(dá)陽性細(xì)胞,以3個視野中陽性神經(jīng)元的數(shù)目占總細(xì)胞的比例為神經(jīng)元純度,經(jīng)鑒定神經(jīng)元的純度為 90%。見圖2A。

          2.3 氟西汀對海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響

          結(jié)果見表1和圖3。不同濃度的氟西汀對海馬神 經(jīng)元形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響是不同的,10 μmol · L-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對照組相比,有突起的神經(jīng)元數(shù) 目增加、最長突起長度增長( P

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            氟西汀對海馬神經(jīng)元生長的影響

            氟西汀對海馬神經(jīng)元生長的影響

            【關(guān)鍵詞】 氟西汀;細(xì)胞培養(yǎng);海馬神經(jīng)元;大鼠

              氟西汀是5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑之一,是應(yīng)用較廣的抗抑郁藥。氟西汀除有抗抑郁作用外,尚可治療其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。有研究表明,氟西汀對海馬的神經(jīng)保護(hù)作用是其發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)的機(jī)制之 一[1]。關(guān)于氟西汀對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長的影響未見報道,本研究初步探討了氟西汀對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長的影響。

              1 材料與方法

              1.1 新生大鼠海馬神經(jīng)元的分離和培養(yǎng)

              技術(shù)方法在參考文獻(xiàn)[2]基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。取出生24 h內(nèi)的新生SD大鼠(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供),無菌分離出雙側(cè)海馬,用顯微剪剪碎,D-Hank's液清洗2或3次,將剪碎的海馬組織轉(zhuǎn)移至離 心管中,加入等量0.25%的胰酶(美國Sigma公司),37 ℃消化30 min,中間振搖1或2次,加入10%的 DMEM/F12(美國Gibco公司)5 ml,輕輕吹打15次,然后1 000 r · min-1離心5 min,制成單細(xì)胞懸液,置于CO2 培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司產(chǎn)品)中,差速貼壁30min,去除成纖維細(xì)胞,吸取未貼壁的細(xì)胞,并用200目 的不銹鋼濾網(wǎng)過濾,收集過濾后的單細(xì)胞懸液于培養(yǎng)皿中,然后至離心管中,取一滴單細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù),并用DMEM/F12將細(xì)胞密度調(diào)到1×106ml-1,然后接種于200 μg·ml-1多聚賴氨酸(美國Sigma公司)包被的6孔培養(yǎng)板中,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),4 h后換為 無血清培養(yǎng)基,即含2% B27的Neurobasl培養(yǎng)基(美國Gibco公司),以后每3天半量換液1次。使用培養(yǎng) 6 d的神經(jīng)元進(jìn)行染色鑒定。

              1.2 大鼠海馬神經(jīng)元的鑒定

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              取培養(yǎng)6 d 6孔培養(yǎng)板中的蓋玻片進(jìn)行神經(jīng)元特異的NSE免 疫組織化學(xué)染色。棄去培養(yǎng)液,4%多聚甲醛室溫固定1 h ,加入 0.3% H2O2甲醇去除內(nèi)源性過氧化氫酶,0.1% TritonX-100破膜,10%綿羊血清封閉,加入一抗1∶200 兔抗鼠 NSE抗體,4 ℃濕盒過夜,0.01 mmol ·L-1PBS清洗,加入二抗1∶200生物素化的山羊抗兔IgG,放入 37 ℃溫箱孵育 60 min;0.01 mmol · L-1 PBS 清洗,滴加SABC過氧化物酶復(fù)合物,37 ℃溫箱中孵育 60 min,0.01 mmol · L-1PBS清洗,滴加 DAB顯色液作用3~10 min,自來水沖洗后,常規(guī)脫水,透明封片。光鏡下觀察NSE表達(dá)陽性細(xì)胞。

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              6孔培養(yǎng)板的細(xì)胞培養(yǎng)7d時,取出蓋玻片進(jìn)行尼氏染色。棄去培養(yǎng)液,0.01 mmol · L-1PBS清洗,4%多聚甲醛室溫固定1 h,0.01 mmol · L-1PBS清洗 3次,氯仿中1 min,95%、70%乙醇各1 min, 蒸餾水清洗,置于1%甲苯胺藍(lán)染液中染色20 min,95%乙醇分化,在顯微鏡下觀察控制,時間以尼氏體顯示清晰為準(zhǔn),37 ℃干燥,二甲苯透明,中性樹脂封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。

              1.3 實(shí)驗(yàn)分組

              在培養(yǎng)的第3天加入氟西汀(常州第四制藥廠生產(chǎn)),根據(jù)藥物濃度不同,將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為5組,分別加 入1、10、20、40 μmol · L-1氟西汀;正常對照組加入等體 積的培養(yǎng)基。

              1.4 海馬細(xì)胞形態(tài)定量分析

              倒置相差顯微鏡(德國Zeiss公司產(chǎn)品)下觀察加 藥48 h后的海馬神經(jīng)元形態(tài),每組各孔隨機(jī)選擇20個視野(每個視野0.17 mm2),記錄每個視野內(nèi)細(xì)胞長出突起的神經(jīng)元數(shù)目,目鏡測微尺隨機(jī)測量15個神經(jīng)元突起的長度和胞體的長徑。

              1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

              應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,各項(xiàng)檢測結(jié)果以x-±s 表示。多組比較及組間兩兩比較采用方差分析。

              2 結(jié) 果

              2.1 海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察

              倒置相差顯微鏡下觀察,培養(yǎng)1 d,細(xì)胞絕大部分貼壁,細(xì)胞形態(tài)大小不一,以單突起的小細(xì)胞為主。培 養(yǎng)6 d,神經(jīng)元胞體較大,突起進(jìn)一步增多、延長,并形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)(圖1)。培養(yǎng)12 d,神經(jīng)元胞體進(jìn)一步增 大,突起形成比較稠密的網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)24 d,神經(jīng)元胞體出現(xiàn)空泡,部分神經(jīng)元死亡,胞體崩解,突觸斷裂。

              2.2 海馬神經(jīng)元鑒定

              NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色:染色后光鏡下觀察第6 天的神經(jīng)細(xì)胞,胞漿和突起被染成棕黃色為NSE抗體 表達(dá)陽性細(xì)胞,以3個視野中陽性神經(jīng)元的數(shù)目占總細(xì)胞的比例為神經(jīng)元純度,經(jīng)鑒定神經(jīng)元的純度為 90%。見圖2A。

              2.3 氟西汀對海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響