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δ-連環素在糖尿病大鼠海馬神經元中的表達
【摘要】 目的 觀察δ-連環素在大鼠糖尿病模型海馬神經元中的表達特征。方法 根據實驗需要將大鼠隨機分成糖尿病組、正常對照組和緩沖劑組。按45 mg/ kg一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(溶于0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液)誘發糖尿病,緩沖劑組只給予等量的緩沖液。應用免疫組織化學方法觀察海馬神經元的形態結構變化，并應用計算機圖像分析技術檢測δ-連環素在各組中的定量表達。結果 糖尿病組大鼠海馬神經元中δ-連環素表達明顯低于正常對照組和緩沖劑組，在海馬齒狀回減少尤為明顯。結論 糖尿病可下調大鼠海馬神經元中δ-連環素的表達。
【關鍵詞】 δ-連環素;糖尿病;海馬;大鼠;免疫組織化學
Abstact：Objective To investigate the characteristics of the expression of δ-catenin in diabetic rat hippocampal neurons. Methods The rats were randomized into diabetic, normal control and buffer groups. The rats in the diabetic group were injected with a single dose of 45 mg·kg of STZ (dissolved in 0.1 mol/L sodium citrate buffer) via the caudal vein to induce diabetes mellitus, and the animals in the buffer group received the same dose of sodium citrate buffer alone. The morphological changes of the hippocampal neurons were observed by immunohistochemical method and the quantitative expression of δ-catenin in each group was determined by computer-assisted image analysis system. Result Immunohistochemical method and quantitative assay revealed that the expression of δ-catenin in the diabetic group was the lowest in the three groups, particularly in the dentate gyrus (DG). Conclusion The diabetic functional disorders of the central nervous system may downregulate the expression of δ-catenin.
Key words：δ-catenin; diabetes; hippocampus; rat; immunohistochemistry
糖尿病神經病變是糖尿病常見的慢性并發癥之一，可引起認知功能障礙及大腦的神經生理和結構改變[1-2]。海馬是與腦高級功能相關的重要結構，在糖尿病患者中易受到損害，表現為更易發生中風、癡呆和認知減退[3]。
δ-連環素屬于P120-catenin蛋白家族，特異性地表達在神經元[4]。研究發現δ-連環素過表達能誘導細胞形成樹突狀突起，并增加原代海馬細胞中樹突的形成[5]。已有報道δ-連環素基因變異小鼠表現出嚴重的學習障礙、突觸可塑性降低和突觸成分的改變。糖尿病患者認知功能減退的機制至今不明，在糖尿病動物海馬神經元中δ-連環素的表達變化也鮮有報道。
1 材料和方法
1.1 動物分組及模型制備 SD雄性大鼠，體重 260～300 g，徐州醫學院實驗動物中心提供。隨機分成正常對照組、緩沖劑組和糖尿病組(n=9)。按文獻[6]方法，一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素45 mg/kg(溶于0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液),緩沖劑組只給予等量的緩沖液。3天后測血糖，血糖>16.7 mmol/L,飲水及尿量明顯增多為造模成功。造模成功后常規飼養60天，中間不進行胰島素干預，也不進行糖尿病飲食控制，造模后每周監測血糖。每組取9只大鼠5%茂巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經心臟先灌注100 ml的生理鹽水后灌注4%多聚甲醛〔0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7.3配制〕固定30 min。動物靜置于4℃冰箱3 h后取大腦，用上述固定液后固定約6 h(4℃)。并修取含海馬腦段，經20%蔗糖-PBS液沉底后，-20℃恒冷切片機切片，片厚20 μm。每個動物均依次等距離間隔選取切片,貼片。
1.2 血糖測定 造模3天和取材前內眥靜脈取血測血糖,血糖測定采用葡萄糖氧化酶法血糖試劑盒。
1.3 SABC法免疫細胞化學反應 切片經：①300 mg/L H2O2 20 min;②4%牛血清白蛋白(4%BSA)封閉，37℃ 30 min;③δ-連環素1∶200，4℃ 18 h后，室溫孵育6 h;④生物素標記IgG 1∶300，室溫孵育2 h;⑤SABC復合物1∶300，室溫孵育1 h;⑥3 mg/L H2O2和5 mg/L DAB顯色，顯微鏡下觀察，出現陽性顆粒后終止反應。反應步驟③～⑥過程中，每步后均用0.01 mol/L PBS，pH 7.3漂洗3次，每次10 min。切片經乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。
1.4 海馬齒狀回DG區δ-連環素陽性反應產物吸光度測定分析 每只動物各取進行過SABC反應的不相鄰切片6張(間隔20 μm)。400倍的高倍鏡下，在海馬DG區隨機選取10個視野，采用Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統對各組δ-連環素反應陽性的細胞進行吸光度的半定量分析。實驗數據用t檢驗進行統計處理。
1.5 統計學方法 所有結果用SPSS 12.0分析。各組之間差異用單因素方差分析檢驗。再用Student-Newman-Keuls進行兩兩比較，結果用±s表示。P<0.05表示在統計學上有顯著性差異。
2 結 果
2.1 大鼠海馬區δ-連環素的表達 結果顯示δ-連環素免疫反應陽性產物呈棕黃色細顆粒狀，在海馬各亞區的神經元胞質和胞膜中均有表達。顯微鏡下觀察到，正常對照組(圖1B，E)和緩沖劑組(圖1C、F)大鼠海馬神經元中的δ-連環素免疫反應的陽性顆粒色深密集，均明顯高于糖尿病組(圖1A、1D)。在海馬齒狀回(DG區)δ-連環素主要表達于顆粒層和顆粒下層，少量表達于門區。大鼠海馬齒狀回δ-連環素的表達在糖尿病組減少更加明顯。正常對照組和緩沖劑組間大鼠海馬神經元中δ-連環素的免疫反應差異不明顯。
圖1 δ-連環素catenin在各組大鼠海馬神經元中表達
其中A(×40)和D(×400)為糖尿病組，B(×40)和E(×400)為正常對照組，C(×40)和F(×400)為緩沖劑組
2.2 海馬齒狀回(DG)δ-連環素陽性反應產物吸光度測定分析 正常組和緩沖劑組海馬神經元中δ-連環素吸光度(absorbance)(A)無明顯差異，但分別高于糖尿病組304%和291%，其差別具有顯著性意義。見表1。表1 各組大鼠海馬齒狀回神經元中δ-連環素表達的定量分析結果
3 討 論
本實驗發現δ-連環素在糖尿病組海馬神經元中的表達低于正常對照組和緩沖劑組，提示大鼠糖尿病的神經性損害對海馬神經元δ-連環素的表達產生了下調作用。
文獻報道在糖尿病小鼠大腦中海馬神經元的發生不足，數量降低。DG區海馬神經元的發生可能與一定的記憶相關[7]。我們在實驗中發現糖尿病組大鼠海馬各亞區神經元變大腫脹，空泡樣變，胞膜破損，及δ-連環素在DG區表達明顯減少，表明δ-連環素表達的減少在糖尿病大鼠認知和學習記憶功能減退方面可能發揮一定作用。
δ-連環素參與鈣黏連蛋白-連環素復合體的構成，在突觸后膜與包括PSD95在內的PSD蛋白組分相互作用，并且在C末端包含1個PZD結合序列[8]。信號復合體(signalosome)是近年發現的激素對細胞進行調節的一種組合模式。已有文獻報道，雌激素與PSD95對神經元突起和突觸的結構調控，正是通過信號復合體的模式進行的[9]，在這一過程中，雌激素與PSD95形成signalosome。當雌激素與PSD95形成signalosome后能夠對神經元突起和樹突棘生長產生調控作用。推測由糖尿病胰島素降低而產生上述實驗結果的原因可能也是通過這種方式。另外在突觸后膜δ-連環素也可能通過PZD結構域在不同的亞細胞區域與其他的蛋白相互作用[8，10]，而胰島素的降低可能促進了δ-連環素與其他的蛋白的相互作用，從而改變突觸塑型，進而引起認知功能和學習記憶功能減退。關于δ-連環素在糖尿病神經損傷過程中的分子生物學機制還需要進一步深入的研究。
【參考文獻】
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