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      2. 褪黑素對PTZ致癇大鼠海馬神經元凋亡的影響

        時間:2024-08-02 01:06:40 藥學畢業論文 我要投稿
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        褪黑素對PTZ致癇大鼠海馬神經元凋亡的影響

        【摘要】  目的  探討褪黑素對癲癇發作中細胞凋亡的影響。方法  將24只成年Wistar大鼠(180~230g)隨機分為NC組、PTZ組和MT組;PTZ組和MT組腹腔注射PTZ(60mg/kg),誘導癲癇發作,NC組腹腔注射等量生理鹽水。MT組按體重10mg/kg于注射PTZ之前20min、立即、后1h、后2h分別經腹腔注射MT并觀察1h,PTZ組于相同時間注射生理鹽水。然后處死大鼠取腦,應用免疫組織化學的方法檢測海馬神經元Bax和Bcl-2蛋白的表達。結果  大鼠海馬神經元Bax的改變:PTZ組明顯高于NC組,MT組明顯低于PTZ組,但高于NC組:大鼠海馬神經元Bcl-2的改變:PTZ組明顯高于NC組,MT組明顯高于PTZ組,也高于NC組。結論  MT可以通過增強海馬神經元Bcl-2的表達和降低Bax的表達而對抗癲癇中細胞的凋亡。
           
            【關鍵詞】  褪黑素;癲癇;戊四氮;Bax;Bcl-2
            
            【Abstract】  Objective  To explore the effect of melatonin on bcl-2 and bax of hippocampus in seizures rats induced by PTZ.Methods  Twenty-four adults Wistar rats (180~230g) were randomly divided into three groups,NC group,PTZ group and MT group.A dose of PTZ(60mg/kg)was intraperitoneally injected into the rats of PTZ group and MT group and seizures was induced.The rats of NC group were administered with the same dose of normal saline.The rats of MT group were administered intraperitoneally with MT(10mg/kg)in 20 minute before injecting PTZ,at one time,1 and 2 hour after injection.Simultaneously the same dose of noraml saline was administered intraperitoneally on PTZ group.The rats were killed.To study the influence of MT on Bcl-2 and Bax immunoreactivity of neruon on hippocampus by using immunohistochemistry method.Results  The number and optical density of Bax in hippocampus of PTZ group rats was higher than that of control group rats.The number and optical density of Bax in hippocampus of MT group rats was lower than that of PTZ group rats,was higher than that of control group rats;The number and optical density of Bcl-2 in hippocampus of PTZ gorup rats was higher than that of control group rats;The number and optical density of Bcl-2 in hippocampus of MT group rats was higher than that of PTZ group rats,was higher than that of control group rats.Conclusion  Melatonin can resistant the apoptosis of hippocampus neruon by increased the expression of Bcl-2 and decreased the expression of Bax.
           
            【Key words】  melatonin;seizure;pentylenetetrazole;bax;bcl-2
           
            難治性癲癇是神經系統的常見病,發病機制至今沒有完全闡明,癲癇長期發作可能造成患者的智力和認知發生改變,給和家庭帶來沉重的負擔。大量動物實驗發現癲癇發作后中樞神經系統存在細胞凋亡,臨床癲癇病人也大多有海馬硬化存在。褪黑素(Melatonin,MT)是松果體分泌的神經內分泌激素,它對人體的作用非常廣泛,近年研究發現它具有抗癲癇發作的報道[1],但是它是否對癲癇發作后神經細胞的凋亡具有保護作用研究較少,本實驗旨在通過觀察MT對戊四氮(pentylenetetrazole,PTZ)點燃大鼠海馬神經元的Bcl-2和Bax的影響,借以了解其對神經元細胞凋亡的保護作用,弄清它在治療癲癇中的進一步作用機制。
           
            1  與方法
           
            1.1  材料  戊四氮及多聚甲醛均為Sigma公司產品,兔抗Bcl-2和Bax抗體購自北京中山試劑有限公司,Wistar大鼠由華中科技大學同濟院動物中心提供,羊抗兔抗體和DAB染色劑購自武漢博士德公司,褪黑素購自Alexis公司。
           
            1.2  MT的制備  MT臨用前用無水乙醇溶解,再加生理鹽水配制,使乙醇的濃度為5%。
           
            1.3  動物飼養與分組  提前1w將大鼠飼養在12h光照(7:00~19:00)12h黑暗(19:00~7:00)安靜的,自由攝食進水,24只健康雄性Wistar大鼠(320~380g),隨機分為三組:一組為PTZ致癲癇組(PTZ組);一組為MT干預組(MT組);一組為正常對照組(NC組),每組8只。PTZ組和MT組各8只,經腹腔注入戊四氮(60mg/kg)誘導癲癇發作,并觀察行為學變化。MT組按體重10mg/kg于注射PTZ之前20min、注射后立即、后1h、后2h分別經腹腔注射MT并觀察1h,PTZ組于相同時間注射等量含5%乙醇生理鹽水。然后,3組全部行心臟灌注固定取材。
           
            1.4  灌注與取材  動物先用10%的水合氯醛(0.3g/kg)腹腔注射麻醉,麻醉顯效后開胸在直視下將穿刺針自左心室插入主動脈,自右心房剪口放血,先快速注入約150ml生理鹽水,然后滴注4%的多聚甲醛500ml,先快后慢,持續約1h,然后斷頭取腦,取出腦組織后修塊(含海馬),將組織塊放入4%多聚甲醛中,2~4h后取出,放入20%的蔗糖中過夜,常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片,片厚4μm。
           
            1.5  免疫組織化學方法(S-P法)  每只動物取8張腦片,4張用于Bax,4張用于Bcl-2。具體步驟如下:(1)切片常規脫臘入水,PBS(pH 7.4)洗3次,每次3min。(2)高壓修復抗原,將切片浸入0.01M的枸櫞酸緩沖(pH 6.0),高壓加熱,噴氣后2min。(3)每張切片滴加1滴過氧化酶阻斷溶液,37℃孵育10min,以阻斷內源性過氧化酶的活性。PBS洗3次,每次3min。(4)每張切片滴加1滴正常山羊血清封閉液,室溫孵育15min。(5)每張切片滴加1滴兔抗Bax和Bcl-2抗體,4℃過夜。(6)PBS洗三次,每次3~5min。(7)除去PBS液,每張切片滴加1滴鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液,37℃孵育25min。PBS洗三次,每次3min。(8)除去PBS液,每張切片滴加2滴新鮮配置的DAB溶液,顯微鏡下觀察3min。(9)自來水沖洗,蘇木素復染,PBS沖洗返藍。(10)切片經過梯度酒精脫水干燥,二甲苯透明,中性樹膠封固。
           
            1.6  圖像分析和數據處理  每只鼠取8張腦片,其斷面水平各鼠均相似,應用HPIAS200彩色病理圖文分析系統進行圖像分析。所有腦片均在同一放大倍數(×200)、同一光強度下分析。首先分析海馬內Bax和Bcl-2平均陽性細胞計數,然后對所選腦區進行陽性反應細胞平均光密度測定。
           
            1.7  學處理  結果用x±s表示。應用SAS統計軟件包分析(醫院統計室提供)。
           
            2  結果
           
            2.1  行為學變化  PTZ組在注射戊四氮后平均1.5min出現眨眼、動須、節律性點頭、肢體抽搐、跌倒等,其中8只出現Ⅴ級發作。MT組在給后平均12min出現眨眼、動須、節律性點頭、肢體抽搐、跌倒等表現,2只出現Ⅴ級發作,3只出現Ⅳ級發作,1只出現Ⅲ級發作,1只出現Ⅱ級發作。行為學的判斷標準按Racine法分為Ⅰ級:濕狗樣顫動,面肌抽動、咀嚼;Ⅱ級:節律性點頭;Ⅲ級:前肢陣攣;Ⅳ級:站立伴前肢陣攣;Ⅴ級:失平衡、傾倒、四肢抽動、全身陣攣。
           
            2.2  免疫組織化學結果  海馬Bax和Bcl-2平均陽性細胞計數,胞體平均光密度值見表1和表2,免疫反應的強弱用平均光密度值表示,顏色越深數值越大。PTZ組Bax平均陽性細胞計數和胞體平均光密度明顯高于正常對照組,MT組明顯低于PTZ組,但高于NC組。PTZ組bcl-2平均陽性細胞計數和胞體平均光密度明顯高于NC組,VAP組明顯高于PTZ組,也高于NC組。

         



        表1  海馬bax陽性細胞平均數目(N)和光密度(D)的比較  (x±s)

        注:*P<0.01 compared with NC group and PTZ group,
            ** P<0.05 compared with NC group

        表2  海馬bcl-2陽性細胞平均數目(N)和光密度(D)的比較  (x±s)

        注:*P<0.01 compared with NC group and PTZ group,
            ** P<0.05 compared with NC group
           
            3  討論
           
            細胞凋亡是能量依賴的細胞內死亡程序活 化而致的“程序性細胞死亡”,是細胞的一種生理性、主動性的“自覺自殺行為”。神經系統發育過程中凋亡現象普遍存在。在許多中樞神經系統疾病中,神經細胞的死亡也涉及凋亡機制,癲癇是神經系統的常見病,癲癇長期發作可以造成患者的智力和認知功能發生改變,其中主要是與癲癇發作導致神經元損害有關,因此臨床發現癲癇病人大多有海馬硬化存在。大量動物實驗發現癲癇發作過程中造成的海馬神經細胞的損害可誘導典型的凋亡現象發生[2]。細胞凋亡與許多基因表達密切相關,有促進凋亡的基因,如Bax;也有某些基因的表達可使細胞抗凋亡能力增強如Bcl-2。Bcl-2可以與Bax結合形成Bcl-2/Bax異二聚體,阻止Bax插入線粒體外膜,保護線粒體電勢梯度,調節細胞內Ca2+的自穩狀態和氧化還原狀態等多方面來抑制凋亡[3]。本研究發現,癲癇發作后Bcl-2、Bax蛋白表達陽性率明顯升高,而正常對照組僅有少量表達,說明癲癇發作可以激發內源性的抗凋亡機制,但是這種保護機制是有限的,長期癲癇發作必將導致大量細胞的死亡,海馬硬化。因此探討有效的抗凋亡機制在保護癲癇發作后的神經元的死亡,提高患者的生活質量,減輕家庭和的負擔具有重要的意義。
           
            褪黑素是松果體腺分泌的一種激素,人體的褪黑素主要來源于松果體腺的分泌。此外,視網膜及胃腸道等組織也可合成褪黑素。其生理作用是調節季節性節律和晝夜節律,此外它還具有鎮靜、催眠、鎮痛、抗抑郁、抗驚厥、調節免疫反應、延緩衰老及調節生殖系統的生長發育等多種生理功能。目前,褪黑素對腫瘤、老年性疾病、心血管疾病和癲癇等的作用機理研究,已成為科學家們關注的熱點。Reiter等[4]研究發現褪黑素可以明顯抑制海仁酸所誘導的癲癇發作;我們的實驗研究也發現褪黑素可以明顯減輕戊四氮所誘導的癲癇發作,使發作的程度減輕,發作的時間縮短。因此褪黑素可以作為一個潛在的抗癲癇物。并且我們的研究還發現,它還可以誘導Bcl-2蛋白的表達,抑制Bax蛋白的表達,使Bcl-2/Bax的比值升高,穩定線粒體膜,從而發揮抗細胞凋亡的作用。其上調Bcl-2和下調Bax表達的具體機制不是很清楚,可能與以下因素有關:(1)MT具有高效的自由基清除能力,可清除體內多種自由基,從而抑制自由基所誘導的Bax的上調表達[5]。(2)褪黑素能夠抑制MDA的產生,減輕氧化損傷所誘導的Bax的上調表達。(3)抑制NF-κB的表達,從而抑制Bax的上調表達[6]。(4)褪黑素可以使細胞內的GABA的濃度升高,興奮性氨基酸(谷氨酸)的濃度降低,使Bcl-2的表達升高。(5)阻止Ca2+通道,抑制線粒體內Ca2+超載所誘導的Bax的表達增加所觸發的細胞凋亡。
           
            總之,褪黑素作為一個潛在的抗癲癇藥物,不僅能夠控制癇性發作,它還可以通過多種途徑抑制細胞的凋亡,減輕癲癇發作所誘導的細胞損傷。

        【參考文獻】

            1  Mohanan PV,Yamamoto HA.Preventive effect of melatonin against brain mitochondria DNA damange,lipid peroxidation and seizures induced by kainic acid.Tocicollett,2002,129(1-2):99-105.    
            2  李震中,阮旭中,白欣立,等.癲癇持續狀態后海馬神經元凋亡的形態學證據.腦與神經疾病雜志,1996,4(4):207.    
            3  Shimizu S,Narita M,Tsujimoto Y.Bcl-2 family proteins regulate the release of apoptogenic cytochrome by the mitochondrial channel VDAC.Nature,1999,399:483-487.    
            4  Reiter RJ.Interactions of the pineal hormone melatonin with oxygen-centered free radicals:a brief review.Braz J Med Biol Res,1993,26(11):1141-1155.    
            5  Iacovitti L,Stull ND,Mishizen A.Neurotransmitters:KCL and antioxidants rescue striatal neurons from apoptotic cell death in culture.Brain Res,1999,816(2):276-285.    
            6  Post A,Holsboer F,Beh1 C.Induction of NF-κB activity during haloperidol induced oxidative toxicity in clonal hippocampal cells:Suppression of NF-κB and neuroprotection by antioxidants.J Neurosci,1998,18(20):8236-8246.

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