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探討RhD陽性血影細(xì)胞的制備及應(yīng)用
摘要:目的： 探討用不同滲透濃度磷酸鹽液（PB）制備的RhD陽性血影細(xì)胞的抗原性及其在抗-D 抗體分離中的作用。方法： 用不同滲透濃度PB作為裂解液，將遺傳表現(xiàn)型為CCDee的RhD陽性O(shè)型紅細(xì)胞制備成血影細(xì)胞，觀察其抗原性；以血影細(xì)胞為固相抗原，用親和層析法從抗D含量為0.814 mg/L的健康人血漿中分離抗-D抗體，檢測相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果： pH7.4、30 mmol/L PB制備的血影細(xì)胞形態(tài)完整，保持較強的抗原性；成功獲得抗-D抗體，回收率達(dá)到84.65 ％，IgG單體加二聚體含量為99.3 %，不含抗A、抗B血型抗體以及IgA、IgM和血紅蛋白。結(jié)論： 用pH7.4、30 mmol/L PB制備的血影細(xì)胞可作為固相抗原，并能從低效價血漿中分離純化抗-D抗體。關(guān)鍵詞: RhD抗原 抗-D抗體 血影細(xì)胞 血漿
抗-D抗體被廣泛用于防止RhD同種免疫[1,2]，同時也用于治療特發(fā)性血小板減少性紫癜[3,4]。目前臨床使用的抗-D抗體均為人為免疫而得的血源制劑[5]，而因妊娠等自然免疫而產(chǎn)生的獲得性抗D抗體，由于其血液中含量少，沒有受到重視而得到利用。2006年用不同滲透濃度的磷酸鹽液（PB）制備RhD陽性血影細(xì)胞，并探討其對血影細(xì)胞抗原性的影響，探索用血影細(xì)胞從含低效價抗-D抗體的血漿中分離純化抗體的方法及其可用性。
1 材料和方法
1.1 材料
健康人血漿（抗D為0.814 mg/L，IgG含量9.63 g/L，貴州省血液中心），Rh表型CCDee的O型紅細(xì)胞（貴州省血液中心），效價為1∶256的抗D（IgG）血型抗體標(biāo)準(zhǔn)品（上海市血液中心），溶血素（中國生物制品質(zhì)量檢測所），F(xiàn)ITC-兔抗人免疫球蛋白（晶美公司），MININEPHTMIgG抗血清（英國The Binding site公司），99/728抗-D抗體標(biāo)準(zhǔn)品(英國The National Institute for Biological Standards and Control， NIBSC)，免疫單擴散板（上海捷門生物技術(shù)合作公司）。8200型超濾器、截留分子量30 kD的超濾膜（美國Millipore公司），3K30型低溫高速離心機（德國Sigma公司），F(xiàn)ACSCabiber式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司），高效液相色譜儀（美國Waters公司），MININEPSAN散射比濁儀（英國The Bingding Site 公司）。
1.2 血影細(xì)胞的制備
O型Rh表型CCDee的紅細(xì)胞，等體積生理鹽水洗滌3次（1 000 r/min×5 min，4 ℃），pH7.4，滲透濃度分別為40、30 和20 mmol/L的PB多次洗滌離心（20 000 r/min×15 min，4 ℃）至上清液無色，沉淀即為含D抗原的血影細(xì)胞。
1.3 血影細(xì)胞形態(tài)和抗原性檢測
在光鏡下觀察血影細(xì)胞的形態(tài)。將血影細(xì)胞與標(biāo)準(zhǔn)抗-D抗體37 ℃孵育30 min，離心取上清液，用RhD篩選細(xì)胞測定其抗體效價，標(biāo)準(zhǔn)抗-D抗體效價減去上清液效價反映血影細(xì)胞的抗原性，相同條件重復(fù)5次。
1.4 血漿抗D-抗體的分離純化
血影細(xì)胞用2%戊二醛2∶1的體積比固定30 min后與血漿按1∶2的體積比例混合，37 ℃輕柔攪拌2 h，離心（1 000 r/min×5 min，4 ℃）棄上清，沉淀的細(xì)胞用10倍體積的pH2.8，0.2 mol/L的甘氨酸－鹽酸緩沖液洗脫，離心（ 1 000 r/min×3 min），洗脫液用0.05 mol/L NaOH調(diào)pH至6.0～6.5，重復(fù)兩次，合并洗脫液，超濾濃縮至原血漿體積的1/5，過濾除菌，冷凍干燥，4 ℃保存。相同條件重復(fù)7次。
1.5 抗體測定
終點散射比濁法測定IgG含量，免疫單擴散法檢測IgA和IgM含量，高效液相色譜法測定IgG單體加二聚體含量，流式細(xì)胞術(shù)測定抗-D抗體含量，鄰甲聯(lián)苯胺法行血紅蛋白定性測定，試管法測定抗A、抗B血型抗體。
2 結(jié)果
2.1 血影細(xì)胞的形態(tài)
用滲透濃度為20 mmol/L的PB制備的血影細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，混有較多細(xì)胞碎片；用30和40 mmol/L的PB制備的血影細(xì)胞呈透明圓形，未見明顯細(xì)胞碎片，但40 mmol/L的PB制備的血影細(xì)胞內(nèi)含有少量血紅蛋白，細(xì)胞中心可見紅色。
2.2 血影細(xì)胞的抗原性
抗-D標(biāo)準(zhǔn)品效價為1∶256，表1顯示血影細(xì)胞與抗-D抗體標(biāo)準(zhǔn)品孵育后，重復(fù) 5次的結(jié)果。用20 mmol/L的PB制備的血影細(xì)胞與抗-D抗體標(biāo)準(zhǔn)品孵育后，四次上清液中的抗體效價為1∶128；而用30和40 mmol/L的PB制備的血影細(xì)胞與抗-D抗體標(biāo)準(zhǔn)品孵育后，上清液中的抗體效價在1∶16與1∶32之間。表1 標(biāo)準(zhǔn)抗體與血影細(xì)胞孵育后上清液的抗體效價（略）
2.3 IgG含量、抗-D抗體含量和回收率
用30 mmol/L PB制備的血影細(xì)胞對血漿進行親和層析得到的制劑中，IgG含量為（4.24±1.53）g/L（n=7），其中單體加二聚體占（99.9±0.25）％（n=7）；抗-D抗體的含量為（3.45±0.31）mg/L（n=7），回收率為（84.65±7.85）％（n=7）；7次重復(fù)得到的制劑均不含抗A、抗B血型抗體以及IgA、IgM和血紅蛋白。
2.4 分離純化過程對血影細(xì)胞的影響
用30 mmol/L PB制備的血影細(xì)胞在2%戊二醛固定后和親和層析后細(xì)胞形態(tài)略變小，而經(jīng)過洗脫液洗脫的血影細(xì)胞比固定后的細(xì)胞形體稍大，但細(xì)胞仍然呈完整圓形，細(xì)胞涂片光鏡下未觀察到細(xì)胞膜的碎片。見圖1。
3 討論
本課題組曾用柱層析法從低效價血漿中分離得到含抗-D抗體的IgG[6]，再用經(jīng)2 ％戊二醛固定的RhD陽性紅細(xì)胞從IgG中純化抗-D抗體。
為提高抗-D抗體的回收率，設(shè)想直接用RhD陽性紅細(xì)胞從含抗-D抗體的血漿中分離純化該抗體。實驗發(fā)現(xiàn)，戊二醛固定30 min的紅細(xì)胞與血漿接觸后出現(xiàn)血紅蛋白溢出現(xiàn)象，延長紅細(xì)胞固定時間和滅活血漿補體仍不能改善。鑒于RhD抗原僅位于紅細(xì)胞膜上，參考Litten等[7，8]方法，利用低滲的裂解液將血紅蛋白從紅細(xì)胞中釋放出來。結(jié)果表明，滲透濃度分別為40、30和20 mmol/L的PB均可使紅細(xì)胞裂解而釋出Hb，成為具有D抗原性的血影細(xì)胞。光鏡下，用40和30 mmol/L的PB制備的血影細(xì)胞呈光滑圓形，未見細(xì)胞膜碎片；40
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