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探討體外培養(yǎng)人牙周膜細胞方法
摘要: 目的： 研究如何提高體外培養(yǎng)人牙周膜細胞（hPDL）的成功率，為簡便、快速地獲得大量成活率高的hPDL膜細胞，建立體外細胞模型提供一定的實驗方法。方法： 利用3種不同方法（組織塊法、酶消化組織塊法、全牙消化法）進行牙周膜細胞的原代培養(yǎng)，用形態(tài)學、免疫細胞化學染色等方法鑒定細胞來源；通過生長曲線的測定研究體外細胞生長特性。結果： 3種方法獲得的細胞形態(tài)和生物學行為大致相同；波絲蛋白抗體染色陽性，角蛋白抗體染色陰性。組織塊法培養(yǎng)的細胞同源性好，但初代培養(yǎng)時間長；全牙消化法的原代培養(yǎng)成功率高于其他2種方法。結論： 通過對牙周膜細胞培養(yǎng)方法的改良，可以顯著提高hPDL原代培養(yǎng)的成功率。
關鍵詞: 牙周膜； 細胞培養(yǎng)； 免疫組織化學
細胞體外分離培養(yǎng)是研究復雜的生物系統(tǒng)的重要手段，細胞培養(yǎng)條件下，將細胞從復雜的體內環(huán)境轉移到較為簡單的體外環(huán)境，可對細胞學研究中的變量進行分離和控制。上世紀70年代以來，國外學者對牙周膜細胞（Periodontal LigamentCells PDL）分離純化進行了大量的探索和研究，且成功地從猴、豬、人等牙周膜分離培養(yǎng)出牙周膜細胞［1～3］。人牙周膜細胞（hPDL）分離培養(yǎng)主要有酶消化法和組織貼塊法［4］。國內外學者對這2種方法評價不一，并且在這2種方法的基礎上進行改進提出了酶消化組織塊法和全牙消化法［5］。對組織塊法、酶消化組織塊法和全牙消化法這3種方法做了一些比較，以尋求hPDL體外培養(yǎng)的最佳方法。
1 材料和方法
1.1 試劑及主要實驗儀器設備
α-MEM 培養(yǎng)液（Hyclone，USA），膠原酶（Type I，Sigma，USA），胎牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶（配成0.25 %,過濾分裝，冷凍保存），青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 mg/L；SABC 免疫組織化學試劑盒（武漢博士德），角蛋白抗體及波絲蛋白抗體（武漢博士德），二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，倒置相差顯微鏡，血球計數(shù)板。
1.2 方法
1.2.1 組織塊法培養(yǎng)hPDL
�。�1）取材：選擇健康青少年（12～18 歲）正畸拔除的健康的雙尖牙，超凈工作臺內用刀片仔細刮除附著牙齦及根尖組織，用 D-Hanks液沖洗 3 次；（2）無菌處理：將牙冠浸入 5.25%次氯酸鈉溶液中 2 min，再用含高濃度雙抗的D-Haks液沖洗2遍。按照司徒鎮(zhèn)強［6］傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)法進行原代培養(yǎng)；（3）傳代：細胞匯合至培養(yǎng)瓶 80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化液1∶2消化傳代。
1.2.2 酶消化組織塊法培養(yǎng)hPDL
酶消化組織塊法原代培養(yǎng)在取材、無菌處理上與組織塊法相同。刮下根中 2/3 的牙周膜后，不剪，移入離心管內。0.1%膠原酶37 ℃消化30 min，其中，每5 min振蕩1次，當肉眼觀察到培養(yǎng)液略混濁，顯微鏡下見組織塊松散時，離心，棄上清液，用含血清及雙抗的培養(yǎng)基漂洗1次后棄上清液，收集組織塊，將組織塊平鋪于培養(yǎng)瓶底，翻轉培養(yǎng)瓶，向內加入 4 ml 培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，使組織塊貼壁，再翻轉培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；傳代與組織塊法相同。
1.2.3 全牙消化法培養(yǎng)hPDL
全牙消化法原代培養(yǎng)牙周膜細胞取材、無菌處理與組織塊法相同。將牙齒放入裝有0.1%膠原酶的青霉素小瓶內，牙根向下，使消化液浸沒牙根，37 ℃溫箱內消化1 h，用吸管充分吹打牙根表面，加入等量含血清的培養(yǎng)基，離心，棄上清液，加入3 ml培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素 100 U/ml、鏈霉素 100 mg/L）吹打形成細胞懸液，移入25 ml培養(yǎng)瓶內，置CO2培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)，3 d換液1次，待細胞鋪至瓶底80%時用0.25%胰蛋白酶1∶2消化傳代。
1.3 細胞的生長情況觀察
1.3.1 倒置相差顯微鏡連續(xù)觀察細胞原代和傳代生長情況。
1.3.2 HE染色
取生長狀態(tài)良好的第5代細胞進行爬片，用蘇木精-伊紅染色，觀察細胞形態(tài)。
1.3.3 細胞免疫化學染色
將培養(yǎng)的第3代hPDL接種于置有蓋玻片的培養(yǎng)瓶中，按常規(guī) SABC 法操作，進行波絲蛋白抗體、角蛋白抗體染色，光鏡下觀察染色情況。
1.3.4 描繪細胞生長曲線
取3塊 24 孔板，分別取3種方法培養(yǎng)的第5代細胞，調整細胞濃度為1×104個/ml接種于 24 孔板，每孔100 μl，CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4 h后每孔加0.5 ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每天每組各取 3孔的細胞作細胞計數(shù)，連續(xù)觀察8 d，繪制細胞生長曲線。
2 結果
2.1 形態(tài)學觀察3種方法培養(yǎng)的hPDL形態(tài)學上無太大區(qū)別，均呈長梭形或星形，胞突細長，胞體豐滿，胞漿均勻，中央有圓形或橢圓型的胞核，細胞呈放射狀、漩渦狀排列（見圖1～3）。HE 染色胞核嗜堿性，胞漿嗜伊紅 （見圖4）。
2.2 免疫組織化學鑒定結果免疫組織化學實驗顯示細胞波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，證明為中胚層組織來源（見圖5、圖6）。
2.3 3種方法培養(yǎng)的hPDL生長情況
2.3.1 組織塊法
牙周膜組織塊經(jīng)靜置貼壁后，一般 8～16 d組織塊邊緣有細胞開始游出，以組織塊為中心成放射狀、漩渦狀生長，生長的細胞以1∶2 傳代培養(yǎng)，最初5代的細胞3～5 d即可長滿培養(yǎng)瓶底，生長狀態(tài)較活躍，核分裂相多見；6～12 代細胞，7～10 d匯合，細胞增殖穩(wěn)定。本實驗用組織塊法培養(yǎng)牙周膜細胞培養(yǎng)了20例，成功1例，成功率5%。
2.3.2 酶消化組織塊法
用此方法所培養(yǎng)的20例中，有4例在5～10 d內觀察到細胞游出，2例傳代成功。細胞以組織塊為中心呈放射狀排列生長。傳代后的細胞生長旺盛，狀態(tài)良好，原代培養(yǎng)成功率為10%。圖1 組織塊周圍長出的牙周膜
2.3.3 全牙消化法
最初消化下來的細胞為圓形，呈懸浮狀態(tài)。24 h 后細胞開始貼壁，48 h 后幾乎全部貼壁。貼壁后的細胞2～3 d開始伸展變形，多數(shù)細胞形態(tài)呈長梭形或星形，少數(shù)呈扁平多角形。從第6天起，細胞生長加速，長梭形及星形細胞增殖活躍，多角形細胞生長相對較緩慢，細胞大約經(jīng)歷12 d后開始形成單層，長梭形細胞占絕對優(yōu)勢。細胞傳至 2～3代時可基本去除上皮樣細胞，4～10 代細胞生長狀態(tài)較好，核分裂相多見，3～5 d可長滿培養(yǎng)瓶底。用此方法原代培養(yǎng)20例，有4例傳代成功，成功
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