探討體外培養的大鼠松果體細胞分泌的松果體素在持續黑暗的環境下

探討體外培養的大鼠松果體細胞分泌的松果體素在持續黑暗的環境下

　　1 引言
　　
　　以前的研究表明，松果體素（melatonin）主要由松果體細胞分泌，它在光照/黑暗（light-dark, L－D）周期下對晝夜節律的調節起著很重要的作用[1, 2]。一般而言，從色氨酸合成松果體素需要一系列的酶促反應。首先，色氨酸從血液循環中被攝取，經過羥化，脫羧，N-乙�；�和氧甲基化，最終形成松果體素。其具體過程如下：色氨酸在色氨酸羥化酶（Tryptophan Hydroxylase, TPH）的作用下羥化為5-羥色氨酸(5-Hydroxytryptophan)。5-羥色氨酸經過芳香氨基酸脫羧酶（Aromatic Amino Acid Decarboxylase）的作用轉化為5-羥色胺。5-羥色胺（5-HT）在N-乙�；�轉移酶（serotonin N-acetyltransferase, NAT）的作用下經過N-乙�；�形成N-乙�；�-5-羥色胺（NAS）。最后通過氧甲基化將N-乙�；�-5-羥色胺（NAS）在羥基吲哚甲基化轉移酶（hydroxyindole-O-methyltransferase，HIOMT）的作用下迅速轉化為松果體素。合成以后的松果體素并不儲存在松果體，而是隨即被動地進入血液循環[3]。
　　光照可以抑制松果體素的分泌，而黑暗則可以促進松果體素的分泌。光照在調節哺乳動物松果體素節律的過程中起著重要的作用。并且，視交叉上核（suprachiasmatic nuclei of thehypothalamus，SCN）是內源性節律產生和調節的主要結構[4]。松果體素節律的產生需要以下幾個步驟：眼睛在光照－黑暗（L-D）條件下對光線的感知；視交叉上核（SCN）中 clock基因的誘導作用；交感神經以節律形式傳來的神經沖動傳到松果體；夜晚去甲腎上腺素(NE)釋放的增多。去甲腎上腺素(NE) 和松果體的α-和β-腎上腺素能受體結合，β-受體的興奮活化腺苷酸環化酶導致細胞內的cAMP 迅速增加[5, 6]。cAMP 作為第二信使，可以調節松果體中N-乙�；�轉移酶（serotonin N-acetyltransferase, NAT）的活性，最終通過兩種方式導致松果體素的合成增加。第一種是通過cAMP 依賴的機制激活N-乙�；�轉移酶（NAT）的活性，其中包括mRNA 和蛋白水平的增加；第二種主要是因為cAMP 可以在一定程度上抑制N-乙�；�轉移酶（NAT）的失活[7]。N-乙�；�轉移酶（NAT）活性的這種節律被認為是松果體素產生節律的主要原因。
　　有文獻報道，體外培養的雞的松果體細胞分泌的松果體素在持續黑暗的環境下仍然具有節律，并且這種節律在體外維持了幾天[8, 9]。雞的松果體素的這種節律產生系統和其他的哺乳動物的并不一樣。雞松果體素合成的節律由兩個oscillators 調節，一個是松果體本身[10,11]，另一個在視交叉上核（SCN）[12]。盡管體內存在兩個clocks，松果體中的clock 足以使體外的N-乙�；�轉移酶（NAT）活性產生節律。
　　不管在光照/黑暗（L－D）周期下，還是在黑暗/黑暗（D－D）環境下，體外培養的蜥蜴的松果體細胞都可以節律性的產生松果體素。并且，據報道，體外培養的蜥蜴的松果體細胞產生的松果體素表現出節律性波動，結果暗示了體外培養的蜥蜴的松果體細胞起著circadian oscillator 的作用[13, 14]。近年來的實驗結果表明，火雞的松果體和視網膜松果體素的產生也表現出晝夜節律[15, 16]。他們報道說，在持續黑暗的環境下，火雞的松果體和視網膜中N-乙酰基轉移酶（NAT）的活性和松果體素的水平均具有晝夜節律。然而，他們的實驗結果表明，火雞的松果體和視網膜中羥基吲哚甲基化轉移酶（HIOMT）的活性不沒有表現出24 小時節律性波動。
　　本論文采用在持續黑暗的環境下體外培養大鼠的松果體細胞，利用放射免疫分析（RIA）的方法檢測大鼠松果體細胞分泌的松果體素水平。目的是為了驗證體外培養的大鼠松果體細胞是否具有 circadian clock 可以調節松果體素的節律性產生。Complex cosine function（CCF）統計分析結果表明，新生大鼠的松果體細胞產生松果體素的內源性節律在持續黑暗的環境下可以維持大約9 天。上述結果暗示，它可以作為一個有用的體外模型來分析節律系統的生理基礎。
　　
　　2 材料與方法
　　
　　2.1 動物和試劑
　　實驗中所用的新生（1 天，SD）大鼠購于安徽省實驗動物中心。母鼠在20－23℃和12:12 光照/黑暗周期（7：00 開燈，19：00 關燈）環境中飼養。動物飼養，關愛和應用都遵循相關法律規則，并且盡量減輕動物的疼痛。
　　細胞培養基 Dubucco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 和胎牛血清（fetal bovineserum, FBS) 購于Gibco 生物公司。緩 沖 液HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), 谷氨酰胺（L-glutamine）, 青霉素（penicillin）, 鏈霉素（streptomycin）, 兔抗5－羥色胺（rabbit anti-serotonin）, 膠原酶（collagenase）, 維生素C（Ascorbic acid）購于Sigma-Aldrich 公司。 Melatonin Research RIAkit 購于 Labor Diagnostika Nord (LDN, Germany)公司。
　　2.2 松果體細胞培養
　　按照以前的文獻所描述的方法體外培養原代的大鼠松果體細胞[17]。首先取出生1 天的SD 幼鼠，75％乙醇消毒，無菌條件下取出松果體，放入冷D-PBS 溶液中。后用0．25％胰酶和100u/ml 膠原酶消化液37℃消化，20 分鐘后用含10％胎牛血清的培養基中止消化，輕輕吹吸細胞數次，將之打散成單細胞。然后1000 轉離心5 分鐘，棄上清。細胞沉淀用完全培養基（DMEM, 10%胎牛血清, 55 μg/ml 丙酮酸鈉, 2mM 谷氨酰胺（L-glutamine）, 25mMHEPES, 0.1mg/ml 維生素C, 4 mg/ml 葡萄糖, 100 units/ml 青霉素，0.1 mg/L 鏈霉素）重懸，并按3х105/ml 的密度接種于6 孔板，并于37℃，5％CO2 條件下培養。
　　2.3 收集細胞培養上清
　　當大鼠原代松果體細胞數達到106 時，收集細胞培養上清，檢測上清中的松果體素水平。為了檢測松果體素的晝夜節律，大鼠原代松果體細胞的培養上清在培養3，6，9，12，15天后分別在白天6：00，8：00，10：00，12:00,15:00 和夜晚18：00，20：00，22：00，1：
　　00，4：00 收集。收集細胞培養上清時注意避光，并且，收集細胞培養上清的時間不超過3分鐘。隨后，收集的細胞培養上清在4℃12000rpm 離心10 分鐘。最后，盡快將細胞培養上清放于－80℃避光保存，以備檢測用。
　　2.4 松果體素放射免疫分析（RIA）
　　大鼠原代松果體細胞培養上清中的松果體素用放射免疫分析（RIA）法檢測，檢測步驟按照公司推薦的進行。檢測試劑盒中標準品的松果體素水平的檢測范圍為0pg/ml-1000pg/ml。松果體素檢測的標準曲線高度相關，相關系數為0 .999。為了減少誤差，每個樣本均檢測兩次。松果體素與N－已酰－5－羥色胺及5－羥色胺的交叉反應分別為0.8%和<0.01%。松果體素檢測試劑盒的靈敏度是0.8 pg/ml。
　　2.5 統計分析
　　體外培養的大鼠松果體細胞分泌的松果體節律用complex cosine function (CCF)分析[18]。曲線的擬合使用非線形回歸（nonlinear regression）分析。當p<0.1 時被認為具有顯著性差別。
　　
　　3 結果
　　
　　在這篇文章中，我們分別收集了體外培養的大鼠松果體細胞在白天 6:00, 8:00, 10:00,12:00 15:00, 和夜晚 18:00, 20:00, 22:00, 1:00, 4:00 各個時間點的培養上清，并用放射免疫方法（RIA）檢測了各個時間點松果體細胞培養上清中的松果體素水平。預期值用平均值±標準差來表示。每一組實驗數據用下列的公式擬合：Y(x) =M+ A24*cos(x – ф24) + A12*cos (2x– ф12)。在這個公式中，x 代表時間點（in radians）。Y 代表在各個時間點x 松果體素水平的預期值。M 代表平均值。A24 和ф24 分別是 24 小時期間的波幅和相位，而A12 和ф12 分別是12 小時期間的波幅和相位。
　　在空的加有胎牛血清的完全培養基中發現有極少量的松果體素(數據未顯示)。CCF 統計分析結果表明，大鼠松果體細胞分泌的松果體素在完全黑暗的環境下體外培養了3，6，9天后各個參數明顯符合CCF（p<0.1），具有晝夜節律。它提示了大鼠松果體細胞松果體素的分泌具有內在節律。但是，這種內在節律在體外培養12 天的時候就消失了。松果體素的波幅第3 天和第6 天的波幅較低，而在第9 天的時候達到最高。但是，體外培養的大鼠松果體細胞分泌的松果體素在第3 天，第6 天，第9 天，第12 天的24 小時平均水平依次升高，在第12 天達到最高，而到第15 天又開始降低。
　　
　　4 討論
　　
　　在這篇文章中，我們用體外培養的大鼠松果體細胞來檢測松果體細胞分泌的松果體素在完全黑暗（D-D）的環境下是否具有內在節律。有趣的是，我們發現，體外培養的大鼠松果體細胞分泌的松果體素具有24 小時節律性波動，并且，這種節律性波動在完全黑暗（D-D）的環境下持續了9 天。這篇文章中的結果和以前的研究結果相一致[19]。不同之處在于他們的實驗中用的是松果體組織，而我們用的是體外培養的松果體細胞。他們報道，雄性大鼠在持續黑暗（D-D）的環境下或大鼠致盲的狀況下其wheel-running activity 仍然存在。他們發現，雄性大鼠的松果體在locomotor activity 比較高的情況下被摘掉時，其松果體中的松果體素水平要比在活性較低的情況下摘掉時的水平要高，并且，統計結果顯示有顯著性差異。
　　以前的實驗結果也已經表明，致盲或者持續黑暗的環境（D-D）可以導致山羊或者hamster松果體細胞產生的松果體素晝夜節律的表達[20-22]。
　　許多實驗結果已經表明，雞的松果體細胞產生的松果體素在光照－黑暗（L－D）環境下甚至在持續黑暗的環境（D-D）仍然表現出晝夜節律[8]。他們用flow-through 培養系統對松果體進行器官培養，發現松果體素的釋放具有節律性波動，而且，雞的松果體素的這種節律性波動在體外培養的條件下至少持續了5 天。在他們的實驗中，松果體素的釋放在光照－黑暗（L－D）環境下表現出比較明顯的節律；然而，在持續黑暗的環境（D-D）中節律的波幅卻越來越低。
　　在這篇文章中，CCF 統計分析結果表明，松果體素的波幅在第9 天的時候達到最高，而第3 天和第6 天的波幅較低。我們推測，松果體素第3 天的內在節律或許是母鼠的遺傳特性，而第3 天的內在節律或許是短暫的過渡性的。然而，松果體素真正的內在特性在第9天形成，但是，這種內在特性在體外培養12 天后就消失了。體外培養的大鼠松果體細胞分泌的松果體素在持續黑暗的環境（D-D）中表現出的節律性波動明顯支持了以下觀點，那就是，大鼠的松果體細胞可以作為circadian oscillator 發揮作用。松果體素的這種內在節律在體外持續一段較長時間的重要性有待進一步研究。

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