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膝骨痹康袋泡熏洗劑提取工藝的優(yōu)化
【摘 要】目的：優(yōu)選用于膝骨關(guān)節(jié)炎的膝骨痹康袋泡熏洗劑的提取工藝。方法：采用L9(34)的正交試驗法，利用高效液相色譜法和紫外分光光度法分別測定柚皮苷和烏頭堿的含量，并以干膏得率、柚皮苷含量和烏頭堿含量的加權(quán)綜合評分作為工藝篩選的評價指標(biāo)，考察膝骨痹康袋泡熏洗劑制劑的水提取加水量、煎煮時間和提取次數(shù)對提取工藝的影響，確定膝骨痹康袋泡熏洗劑的最優(yōu)提取工藝。結(jié)果：膝骨痹康袋泡熏洗劑最優(yōu)提取工藝為15倍加水量，煎煮3次，每次1 h，驗證3批所得樣品平均的干膏得率、柚皮苷含量和烏頭堿含量分別為20.73%、102.5 mg、22.4 mg，與正交試驗結(jié)果相符，達到優(yōu)化效果。結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝簡便、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于膝骨痹康袋泡熏洗劑的工業(yè)化生產(chǎn)，為該制劑的進一步研究奠定良好的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝;袋泡熏洗劑;提取工藝;正交優(yōu)化
膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)屬中醫(yī)學(xué)“膝骨痹”范疇，是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病，多見于中老年人，女性多于男性。KOA的發(fā)生發(fā)展是一種長期、慢性、漸進的病理過程，對早、中期患者治療在于控制關(guān)節(jié)疼痛、延緩或阻斷殘疾進展、恢復(fù)關(guān)節(jié)活動功能[1-3]。
作為傳統(tǒng)中藥外治法之一的熏洗法，具有理療和中藥的雙重治療作用，同時通過經(jīng)皮給藥可以避免肝臟的首關(guān)效應(yīng)及胃腸道影響，醫(yī)患均易于控制給藥并維持穩(wěn)定而持久的藥物濃度，在治療KOA方面取得良好的效果[4-6]。但熏洗過程中需要患者自行煎煮藥湯，較為費時、繁瑣，極大地降低了患者依從性。膝骨痹康袋泡熏洗劑由骨碎補、制川烏、艾絨、紅花等藥材組成，具有祛風(fēng)濕、止痹痛、通經(jīng)絡(luò)、強筋骨之功效，是臨床外用熏洗治療KOA的經(jīng)驗方，適用于肝腎氣血虛損、風(fēng)寒濕瘀痹阻為基本病機的KOA患者，對緩解疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)功能障礙等療效確切。
本研究擬將其改為袋泡熏洗劑，以君藥骨碎補中的藥效成分柚皮苷以及臣藥川烏中的烏頭堿為指標(biāo)，通過L9(34)正交試驗，開展袋泡熏洗劑提取工藝的優(yōu)化試驗，為該制劑的新藥研制奠定基礎(chǔ)。
1 試驗材料
1.1 試驗儀器 雙光束紫外可見分光光度計(TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6，國華電器有限公司);高效液相色譜儀(LC-20A，SPD-M20A PDA檢測器，LC-20AT四元梯度泵，CTO-20A柱溫箱，SIL-20A自動進樣器，日本島津公司);色譜柱(Diamonsil C18 5 u 250 mm×4.6 mm);萬分之一電子分析天平(FA604A，上海精天電子儀器有限公司);超聲波清洗器(KQ-400E，昆山市超聲儀器有限公司);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240，上海精宏試驗設(shè)備有限公司)。 1.2 試驗藥材 研究所需藥材購于福建百晟藥業(yè)有限公司。槲寄生(產(chǎn)地河北，批號1406005);骨碎補(產(chǎn)地江西，批號1408005);續(xù)斷(產(chǎn)地湖北，批號1407007);伸筋草(產(chǎn)地江西，批號1405005);透骨草(產(chǎn)地湖南，批號1404004);海桐皮(產(chǎn)地貴州，批號1403003);艾絨(產(chǎn)地安徽，批號20140506);制川烏(產(chǎn)地四川，批號131101);制草烏(產(chǎn)地山西，批號131015);白芷(產(chǎn)地安徽，批號20140618);威靈仙(產(chǎn)地遼寧，批號1404004);川芎(產(chǎn)地四川，批號20140408);川椒(產(chǎn)地四川，批號140301);紅花(產(chǎn)地新疆，批號20140418)。
1.3 試驗試劑 研究所需烏頭堿對照品(0720-9807)購于中國食品藥品檢定研究院，柚皮苷對照品(110722-201312)購于中國藥品生物制品檢定研究院。甲醇為色譜純，三氯甲烷、冰醋酸等試劑均為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 正交試驗設(shè)計 前期預(yù)試驗以水為溶媒，對復(fù)方藥材進行水提，并以柚皮苷及干浸膏得率的綜合評分為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)對結(jié)果有明顯影響。根據(jù)預(yù)試驗并參考文獻[7]，本研究對加水量(A)、煎煮時間(B)、煎煮次數(shù)(C)進行正交試驗考查，各因素擬定3個水平，見表1。以加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)3個因素為考察對象，以干浸膏得率、柚皮苷含量、烏頭堿含量的綜合評分作為確定最佳提取工藝的衡量指標(biāo)，選用L9(34)正交試驗表進行試驗，見表2。其中D列為自動生成的誤差列，篩選最佳的提取工藝。柚皮苷(Ⅰ)和烏頭堿(Ⅱ)為復(fù)方中代表性的有效成分，選擇其作為評價指標(biāo)之一，權(quán)重系數(shù)各定為0.4，而作為有效成分煎出間接控制的一個指標(biāo)，藥效物質(zhì)提取的多少可以從干膏得率(Ⅲ)的大小來判斷，權(quán)重系數(shù)定為0.2，進行綜合評價，篩選最佳工藝。準(zhǔn)確稱取除紅花外的復(fù)方藥材9份，每份158 g，按L9(34)正交試驗所示條件提取，濾過，合并提取液，將其水浴蒸發(fā)濃縮，烘箱減壓干燥，得干浸膏作為各供試樣品備用。綜合評分=(Ⅰ/Ⅰmax×0.4 + Ⅱ/Ⅱmax×0.4 + Ⅲ/Ⅲmax×0.2)×100。
2.2 指標(biāo)測定
2.2.1 干浸膏得率的測定 提取液濃縮后置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，置烘箱中減壓干燥至恒重，稱重。計算干浸膏得率，干浸膏得率(%)=干膏量/藥材總量×100%。結(jié)果見表2，方差分析見表3。
2.2.2 柚皮苷含量測定
2.2.2.1 對照品溶液的制備 柚皮苷對照品精密稱定2.01 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度得對照品溶液，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為201 μg・mL-1。
2.2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取1.6 g各提取方法所得的干浸膏，至25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，密塞，超聲10 min，靜置10 min，并用甲醇定容至刻度。取上清液，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，得續(xù)濾液作為供試品溶液備用。按處方比例及工藝制備不含骨碎補的陰性樣品，同法制備陰性樣品溶液。
2.2.2.3 色譜條件 色譜柱Diamonsil C18(5 μm，250 mm×4.6 mm);流動相乙腈∶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的醋酸水= 19∶81;檢測波長為283 nm;流速為1.0 mL・min-1，柱溫為25 ℃;進樣量為10 μL。
2.2.2.4 專屬性考察 分別取2.2.2.1項下對照品溶液、2.2.2.2項下供試品液、陰性樣品溶液，按上述HPLC分析條件測定，進樣10 μL，結(jié)果表明，陰性樣品溶液在柚皮苷峰位處無干擾，證明此法具有良好的專屬性，見圖1。
2.2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取對照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20.1，40.2，60.3，80.4，100.5 μg・mL-1，按2.2.2.3項下條件進行測定，記錄色譜圖。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，得柚皮苷回歸方程為Y = 18 722 C-33 165(r = 0.999 9)，結(jié)果表明，柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20.1～100.5 μg・mL-1范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。
2.2.2.6 精密度試驗 精密稱取60.3 μg・mL-1柚皮苷對照品溶液，重復(fù)進樣6次，測得峰面積，計算柚皮苷含量，結(jié)果RSD為0.99%，表明儀器精密度良好。
2.2.2.7 重復(fù)性試驗 取供試品溶液6份，分別進樣，測定柚皮苷峰面積，并計算其RSD值。結(jié)果RSD為1.59%，說明該方法的重復(fù)性好。
2.2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h進樣測定柚皮苷峰面積，并計算其RSD值。結(jié)果RSD為1.3%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.2.9 加樣回收率試驗 取已知柚皮苷含量供試品溶液6份，分別加入同質(zhì)量的柚皮苷對照品，按供試品溶液制備方法制備樣品，按上述色譜條件進樣分析，記錄峰面積，結(jié)果表明，柚皮苷平均加樣回收率為107.4%，RSD為1.26%。
2.2.3 烏頭堿含量測定
2.2.3.1 對照品溶液的配制 精密稱定烏頭堿對照品5 mg，置50 mL容量瓶中，加三氯甲烷溶解烏頭堿對照品，并定容至刻度，搖勻，即得100 μg・mL-1烏頭堿對照品溶液。
2.2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取8.05 g生藥量的9種正交試驗方法所得的干浸膏量樣分別為0.95，1.35，1.65，1.1，1.35，1.0，1.2，0.8，1.25 g，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氨試液使?jié)駶�，靜置5 min，加三氯甲烷8 mL，渦旋5 min，3000 r・min-1的離心速度離心10 min，取下層，即得供試品溶液，紫外分光光度計在200～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在241 nm處有最大吸收。
2.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對照品溶液0.5，1，2，4，6 mL于10 mL的容量瓶中，加三氯甲烷定容至刻度，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5，10，20，40，60 μg・mL-1。于241 nm波長處測定吸光度，以三氯甲烷作為空白。以吸光度A值為縱坐標(biāo)，對照品溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)C為橫坐標(biāo)，得烏頭堿的線性方程為A = 0.008 1 C + 0.062 7(r = 0.998 1)，結(jié)果表明烏頭堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5～60 μg・mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.3 正交試驗提取優(yōu)選結(jié)果 按照2.2.2與2.2.3項下的方法分別測定由正交試驗設(shè)計的9種提取方法而得的柚皮苷和烏頭堿的含量，結(jié)果見表2。由表2可知，各因素影響提取效果的因素順序為C > A > B。表3與表4的方差分析結(jié)果表明，C對干浸膏得率的影響，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)。但3種因素對綜合評分的影響比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05)。結(jié)合工業(yè)化生產(chǎn)的實際情況，確定從柚皮苷含量、烏頭堿含量及干浸膏得率的綜合評分優(yōu)選出提取工藝為A2B2C3，即加15倍的水，煎煮3次，每次1 h。
3 驗證試驗
為了驗證上述結(jié)論的準(zhǔn)確性，按照最佳工藝條件A2B2C3進行3次試驗，結(jié)果干浸膏得率、烏頭堿、柚皮苷含量平均值分別為20.73%、22.4 mg、102.5 mg，驗證結(jié)果與正交試驗結(jié)果基本一致，證明該工藝穩(wěn)定可行。
4 討 論
本試驗通過水提方法，經(jīng)正交試驗優(yōu)選，得最優(yōu)提取工藝為A2B2C3，即加15倍的水，煎煮3次，每次1 h。提取工藝簡便、廉價，且工藝驗證試驗顯示，該工藝穩(wěn)定，可行性高。在柚皮苷含量測定時，預(yù)試驗通過參考相關(guān)文獻嘗試改變流動相比例[8]，如流動相乙腈與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的醋酸水比例為20∶80和18∶82，發(fā)現(xiàn)樣品分離度和峰形較差，而調(diào)整流動相乙腈與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的醋酸水比例為19∶81，對照品和樣品得以較好分離，符合含量測定要求。這表明針對具體的檢測指標(biāo)，對于常規(guī)的檢測方案有時進行細(xì)微的調(diào)整是必要的。
中藥的提取工藝對保持中藥復(fù)方的療效具有直接影響，同時中藥的提取工藝路線應(yīng)與所選擇的劑型相關(guān)，適宜的提取工藝是中藥劑型改進和創(chuàng)新的前提和基礎(chǔ)。為了發(fā)揮中藥復(fù)方整體效應(yīng)與綜合作用，使復(fù)方中多種成分同時提取，需要選擇一種可讓多種有效成分最大溶出的溶媒。本研究根據(jù)膝骨痹康袋泡熏洗劑的臨床用法特點及復(fù)方中中藥有效成分的特點，同時根據(jù)制劑工藝的可行性、經(jīng)濟性且易于產(chǎn)業(yè)化的考慮，對復(fù)方中除紅花以外的其他中藥進行共煎水提。
合理選擇評價指標(biāo)，篩選出最佳工藝條件，是中藥制造現(xiàn)代化研究的重要領(lǐng)域[9]。中藥袋泡熏洗劑指中藥材經(jīng)過一定的工藝制備后，裝入以纖維濾紙為包袋材料的袋中，再放于開水或熱水中浸泡使用的一種制劑。膝骨痹康袋泡熏洗劑共有14味中藥，共奏祛風(fēng)濕、止痹痛、通經(jīng)絡(luò)、強筋骨之功效。然而其中有效成分復(fù)雜，作用機制不明確，根據(jù)文獻[10-13]復(fù)習(xí)及組方藥物特點，結(jié)合KOA肝腎氣血虛損、風(fēng)寒濕瘀痹阻的基本病機特點，本試驗選取了該方中補肝腎、壯筋骨的君藥骨碎補及祛寒濕、止痹痛的臣藥制川烏的主要成分作為觀察指標(biāo)。骨碎補始載于《本草拾遺》，現(xiàn)代研究表明，骨碎補能增強成骨細(xì)胞活性、提高骨密度、維持骨微結(jié)構(gòu)的完整程度，是腎主骨生髓的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[14]。骨碎補浸膏以水為溶劑時提取效果較好[15]，柚皮苷為一種雙二氫黃酮類化合物，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有較好的耐熱性，是骨碎補的主要活性物質(zhì)之一，有益于骨關(guān)節(jié)傷病的愈合[16];烏頭堿為制川烏的主要成分，故筆者選擇烏頭堿與柚皮苷的含量及復(fù)方浸膏得率的加權(quán)綜合評分作為膝骨痹康袋泡熏洗劑的提取評價指標(biāo)，這種評價相對較客觀可靠。
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