大鼠饑餓中依賴嗅覺的探索行為及神經(jīng)機制
攝食行為是動物最基本也最重要的行為方式，嚙齒類動物通過嗅覺系統(tǒng)，完成食物的搜索，嗅覺系統(tǒng)對嚙齒類動物的生存至關重要，下面是小編搜集整理的一篇探究饑餓嗅覺探索行為神經(jīng)機制的論文范文，歡迎閱讀查看。
饑餓可以定義為驅(qū)動個體尋找和消化食物的感覺或動力[1].攝食及覓食行為是動物的最基本行為，以嗅覺系統(tǒng)為導向是嚙齒類動物覓食的重要特點，嗅覺系統(tǒng)的基本構(gòu)成包括位于嗅粘膜上的感覺神經(jīng)元，大腦前端的嗅球，以及嗅皮層，嗅皮層中最關鍵部分為梨狀皮層[2].感覺神經(jīng)元及嗅球最主要的功能是對不同的氣味分子進行識別，并形成精確的空間定位[3].嗅皮層主要完成對嗅覺信號的整合，形成嗅覺記憶，并把特定嗅覺信號和其他諸如顏色、味道、形狀、空間位置等感覺信息進行整合[4].
動機的形成有先天遺傳，也有后天的經(jīng)驗和學習，但均依賴于腦內(nèi)特定的神經(jīng)環(huán)路及遞質(zhì)系統(tǒng)[5].動物的覓食動機和其饑餓狀態(tài)密切相關，饑餓狀態(tài)下動物的覓食動機增強，反應在嗅覺系統(tǒng)對食物發(fā)出的氣味分子更加敏感，探索行為更加強烈[6].但對于饑餓狀態(tài)下，動物覓食行為的反應和梨狀皮層的關系尚不清楚。本實驗以大鼠為研究對象，利用食物埋藏，觀察大鼠饑餓狀態(tài)下依賴嗅覺的探索行為的變化，在此基礎上，利用熒光金標記技術觀察嗅球到梨狀皮層的投射變化，利用c-fos標記技術研究梨狀皮層神經(jīng)元活化水平。
一、材料和方法
1材料
雄性SD大鼠16只，體重250~300g,由蘭州大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心提供。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規(guī)定。腦立體定位儀(成都泰盟公司，DW-2000腦立體定位儀)、冰凍切片機(Ther-mo,CryotomeE)、抗c-fos一抗(Sigma,A40215,1∶500)、熒光顯微鏡(Olympus,DP22)、偶聯(lián)cy3二抗(Bioss,bs-0296a-cy3).
2方法
2.1動物和分組雄性SD大鼠16只，安靜環(huán)境飼養(yǎng)，12小時光照周期，溫度22~25℃，濕度65~75%之間，自由攝食飲水。16只大鼠隨機分成2組：禁食組(fastinggroup),正常組(controlgroup),每組8只，禁食組大鼠禁食48h,正常對照組給予正常飲食。
2.2嗅球置管大鼠用7%的水合氯醛(40mg/kg)腹腔麻醉，俯臥位，固定在立體定位儀上，頭部正中切口，剝離骨膜，使前后囟位于同一水平面。參照大鼠腦圖譜，將長4.1cm、內(nèi)徑0.3mm、外徑0.4mm的不銹鋼帶內(nèi)芯套管植入大鼠左側(cè)嗅球(anteri-ortobregmaat7.7mm;laterialfrommidlineat1.6mm;deepfromskuat5mm),牙科水泥結(jié)合螺釘固定套管，旋緊套管帽，術后1周，創(chuàng)傷完全恢復，開始實驗。
2.3清醒狀態(tài)下的熒光金注射禁食組連續(xù)禁食48h后，大鼠頭部固定，利用微量注射泵經(jīng)套管注射10%的熒光黃2μl,注射結(jié)束，旋緊套管帽。立即置于大鼠食物埋藏箱，并記錄大鼠找到全部食物的總時間。
2.4埋藏食粒法評價大鼠的嗅覺探索行為食物埋藏箱用正方形透明塑料盒制成(45cm×20cm×20cm),底部鋪5cm厚度的顆粒墊料，墊料經(jīng)消毒處理，和前期所用墊料相同。食物顆粒埋藏在大約1cm深處，位置如Fig.1A所示：共放置4枚食物，記錄找到4枚食粒的總時間。嗅覺探索行為結(jié)束后6h,立即處死動物。
2.5全腦固定與切片嗅覺探索結(jié)束后6h,全部大鼠用7%的水合氯醛(40mg/kg)腹腔麻醉，打開胸腔，用250ml生理鹽水經(jīng)左心室快速灌注沖洗，再用4%多聚甲醛(PB配制，pH7.4)250ml灌注固定，立即開顱取腦，置人固定液4℃下過夜，再轉(zhuǎn)入20%蔗糖溶液(PB配制，pH7.4)4℃下放置，待沉底后，再移入30%蔗糖溶液(PB配，pH7.4)4℃下放置，待沉底后，連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚30μm,放置于冷凍保護液內(nèi)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.6c-fos免疫熒光組織化學技術分析梨狀皮層神經(jīng)元活化水平根據(jù)大鼠腦圖譜，界定梨狀皮層位置，如Fig.1B所示。選取6張梨狀皮層平面，分別位于Bregma1.92mm,1.56mm,1.2mm,0.84mm,0.48mm,和0.12mm,相鄰切片之間距離為360μm.利用漂片法進行c-fos的免疫熒光染色，根據(jù)常規(guī)免疫熒光方法，抗c-fos一抗(Sigma,1∶500),4℃,孵育24h,漂洗，偶聯(lián)cy3的二抗，室溫下避光孵育1h,漂洗，貼片，甘油封片，熒光顯微鏡觀察。
2.7熒光顯微鏡觀察FG及C-fos陽性神經(jīng)元在梨狀皮層的分布完成c-fos免疫熒光染色的腦片置于熒光顯微鏡下，首先用530nm的激發(fā)光顯示cy3,在左側(cè)梨狀皮層拍照，位置不變，轉(zhuǎn)換到紫外光，顯示FG,并拍照。每張腦切片在左側(cè)梨狀皮層，20倍物鏡下拍兩個視野。
2.8細胞計數(shù)方法采用盲法計數(shù)，分別計數(shù)每個視野下c-fos陽性細胞，F(xiàn)G陽性細胞，以及c-fos和FG雙陽性細胞。每只動物計數(shù)6張腦片，12個視野，最后用每個視野的均值代表陽性細胞的數(shù)量。統(tǒng)計學處理：全部數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x珋±s)表示，組內(nèi)比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)處理用SPSS17.0version的統(tǒng)計軟件進行，P<0.05表示差異具有顯著性。
二、結(jié)果
1饑餓對嗅探索行為的促進作用
利用食物埋藏箱檢測饑餓對大鼠嗅覺探索行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，饑餓組大鼠找到全部8個食粒的時間明顯短于非饑餓組，結(jié)果見Fig.2.這說明饑餓促進了覓食動機，同時也有嗅覺敏化作用，能夠很快對食物的嗅覺信號產(chǎn)生記憶。
2梨狀皮層FG標記的神經(jīng)細胞數(shù)量變化
為觀察饑餓誘導的嗅覺探索行為敏化對嗅球到梨狀皮層投射的逆向軸漿運輸有何影響，我們采用嗅球注射FG,觀察嗅覺探索行為是否能夠促進從嗅球到梨狀皮層的軸漿運輸效能，F(xiàn)G注射后6h,處死動物，觀察在此期間FG在梨狀皮層神經(jīng)細胞的聚集情況，間接反應梨狀皮層神經(jīng)細胞的活動狀態(tài)。結(jié)果可見，饑餓組梨狀皮層FG陽性細胞數(shù)量明顯增加，和非饑餓組比較差異有顯著性。
3梨狀皮層C-fos標記的神經(jīng)細胞數(shù)量變化
c-fos可以標記刺激活動依賴性神經(jīng)元。饑餓對大鼠嗅覺探索具有促進作用，這一促進作用，僅僅是嗅球?qū)用妫�是涉及到高一級神經(jīng)元，我們利用c-fos免疫熒光技術，結(jié)合半定量，觀察梨狀皮層在嗅覺探索行為誘導的神經(jīng)細胞活化方面有無差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，饑餓組梨狀皮層c-fos陽性神經(jīng)細胞的數(shù)量也增加了。
4梨狀皮層FG+/C-fos+雙標記神經(jīng)細胞數(shù)量的變化
為了進一步觀察嗅刺激誘導的活化神經(jīng)元，是否也存在逆向軸漿運輸?shù)脑黾樱覀兝肍G和c-fos雙標記技術，結(jié)合半定量觀察梨狀皮層FG/c-fos雙陽性細胞的數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，饑餓組雙陽性細胞的數(shù)量也明顯多于非饑餓組，兩組之間比較有差異性，結(jié)果見Fig.5.
三、討論
1梨狀皮層對嗅覺信號的整合
攝食行為是動物最基本也最重要的行為方式，嚙齒類動物通過嗅覺系統(tǒng)，完成食物的搜索，對特定食物通過食物的特定氣味形成記憶，區(qū)別有毒和無毒，因此嗅覺系統(tǒng)對嚙齒類動物的生存至關重要，嚙齒類動物因此也進化出了發(fā)達的嗅覺系統(tǒng)，大鼠的嗅粘膜占鼻黏膜的比例，以及嗅腦占全腦的比例都遠遠高于人類，嗅粘膜感受氣味信號之后，特定的氣味分子通過激活一種或是幾種G蛋白偶聯(lián)受體，引起神經(jīng)細胞內(nèi)cAMP依賴性的鈉離子通道開放，完成從化學信號向電信號的轉(zhuǎn)換，并進而向上經(jīng)感覺神經(jīng)元的軸突，將此信息傳導至特定的.嗅小球，完成氣味信號的空間定位[7].而更為復雜的氣味信號分析和整合，則依賴于更高位的中樞結(jié)構(gòu)，如梨狀皮層，梨狀皮層對嗅覺信號的分析可能和特定嗅覺記憶有關，也可能參與了嗅覺的敏化和鈍化過程[8].
我們的研究表明，饑餓導致的嗅覺敏化和對特定食物的嗅覺記憶和梨狀皮層關系密切，在饑餓大鼠攝食行為過程，伴隨有從嗅球腦到梨狀皮層的投射增強，軸漿運輸增加，F(xiàn)G陽性細胞在梨狀皮層數(shù)量明顯增加。
2嗅覺敏化對梨狀皮層的激活
在饑餓狀態(tài)下，動物對食物的敏感度增加，包括對食物的嗅覺探索，這種嗅覺敏化，一方面可能涉及饑餓狀態(tài)下和食物氣味相關的受體分布會增加[9],另一方面從嗅球到高位皮層的神經(jīng)激活也會增加，我們的研究發(fā)現(xiàn)梨狀皮層神經(jīng)元表達c-fos的細胞數(shù)量增加，這表明饑餓狀態(tài)下以嗅覺為導向的覓食行為和梨狀皮層神經(jīng)元活化有密切的聯(lián)系。
3梨狀皮層可能參與嗅覺探索行為的動機
形成行為的產(chǎn)生除行為執(zhí)行的器官之外，動機是確保行為發(fā)放的關鍵，腦內(nèi)有和動機相關的腦區(qū)，通過特定的神經(jīng)環(huán)路，決定行為是否發(fā)放，何時發(fā)放，其中前額皮層(PFC)在動機形成中起關鍵作用，而梨狀皮層和PFC之間有往返投射，因此梨狀皮層可能參與了嗅覺主導的動機形成[10,11].
在過去十余年時間內(nèi)，對氣味分子的識別機制，嗅粘膜到嗅球的投射規(guī)律，嗅小球?qū)μ囟ㄐ嵊X信號的空間定位都有了比較深入的了解，但高位皮層對嗅覺信號的整合、調(diào)制，如何完成嗅覺記憶及嗅覺的敏化和鈍化，依然有很多不清楚的地方。我們的實驗發(fā)現(xiàn)在饑餓狀態(tài)下，嗅覺探索行為的敏化和效能提高有大量梨狀皮層神經(jīng)元的參與。
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