Tie2在鼠急性肺損傷中的表達及意義
【摘要】 目的 探討Tie?2在急性肺損傷（acute Iung injury,ALI）中的表達及意義。方法 24只Wistar大鼠隨機分為對照組與模型組，每組各12只，對照組采用假手術處理，模型組采用盲腸結扎穿孔術（cecal ligation and puncture,CLP）制作ALI模型，分別于假手術及CLP術后12 h處死全部大鼠，取右肺石蠟包埋，行HE染色，采用免疫組織化學法檢測Tie?2在鼠肺組織中的表達分布。結果 對照組在支氣管上皮細胞、平滑肌細胞及內皮細胞表達Tie?2。模型組在肺泡間隔及肺泡腔內中性粒細胞及巨噬細胞均有強陽性的表達，在Tie?2陽性的炎癥細胞附壁區域，內皮細胞Tie?2表達亦增強，支氣管上皮細胞表達相對減弱，平滑肌細胞表達未見明顯差別。結論 ALI模型鼠肺組織中中性粒細胞及巨噬細胞表達Tie?2，同時內皮細胞Tie?2表達增強。
【關鍵詞】 急性肺損傷； Tie?2；盲腸結扎穿孔術
【Abstract】 Objective To explore expression and significance of and Tie?2 receptor in a rat model of acute lung injury. Methods The rat model of acute lung injury(ALI) was made by cecal ligation and puncture(CLP). Wistar rats were devided into control group and model group,and were killed 12 hours after shaming or CLP. Right lungs were embedded in paraffin.The expression and distribution of Tie?2 receptors in lung was observed by Immunohistochemistry. Results Tie?2 receptors were expressed in bronchial epithelial cells，smooth muscle cells and endothelial cells in control group.There were higher expressions on neutrophils and macrophages in lung interstitial and alveolar space. In adhesion location of Tie?2 receptors positive inflammatory cells,there was higher staining in endothelial cells, whereas there were relatively decreased expressions on bronchial epithelial cells. There were no distinct difference on smooth muscle cells between two groups.Conclusion Neutrophils and macrophages express Tie?2 receptors,and meanwhile endothelial cells have higher expressions in the lung of the rat model of acute lung injury.
【Key words】 acute lung injury,Tie?2,cecal ligation and puncture
急性肺損傷（Acute Lung Injury,ALI）常是嚴重感染中毒癥(severe sepsis)的嚴重并發癥，病理上表現為肺部大量炎性細胞的浸潤，肺水腫的形成。Tie?2為血管生成素（Angiopoietin,Ang）家族受體，研究發現Tie?2在炎癥反應中起重要作用，在鼠ALI模型中存在Tie?2表達下降及磷酸化受阻現象［1］，但其具體表達分布不明。本研究通過盲腸結扎穿孔術（cecal ligation and puncture,CLP）誘導sepsis制作鼠ALI模型，檢測Tie?2在ALI鼠肺臟中的表達分布并探討其在ALI中的意義。
1 材料與方法
1.1 實驗主要試劑 濃縮型Tie?2兔抗鼠多克隆抗體、sABC試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自中杉金橋生物技術有限公司。
1.2 實驗分組 健康清潔級成年雄性Wistar大鼠24只（山東大學實驗動物中心提供），隨機分為兩組，對照組12只，模型組12只。
1.3 ALI大鼠模型制備及標本處理
1.3.1 ALI大鼠模型制備：術前大鼠禁食12 h，禁水8 h，3%水合氯醛行腹腔麻醉，75%乙醇消毒腹部，沿腹白線中段作一長1.5 cm的切口,剪開皮膚和肌層，探查腹腔分離盲腸，在距盲腸末端1 cm處用3?0絲線結扎盲腸，注意避免結扎盲腸動脈及引起腸梗阻，用16 G穿刺針在盲腸游離面（腸系膜對面）上貫穿3次，針孔間距約3 mm，并擠出少許內容物，還納腸管。術畢逐層關腹，并于腹壁皮下注射林格液3 ml /100 g抗休克處理。術后自由進食飲水。對照組僅做無菌開腹與盲腸翻動。
1.3.2 標本處理：分別于假手術及CLP術后12 h處死全部大鼠，剪取右肺組織，常規石蠟包埋，HE染色觀察肺部病理變化，免疫組化sABC法觀察Tie?2表達分布，具體步驟按試劑盒說明操作。
2 結果
2. 1 肺組織病理學變化 對照組大鼠肺臟光鏡下肺組織結構清楚，肺間質有僅有少許炎性細胞，肺泡壁結構完整，肺泡內未見水腫液及肺泡萎陷（圖1）。模型組光鏡下見肺泡間隔增厚，肺間質充血水腫，大量中性粒細胞及少量巨噬細胞浸潤，部分肺泡萎縮塌陷（圖2）。
2.2 免疫組化病理結果分析 對照組Tie?2主要表達于支氣管上皮細胞（圖3）、內皮細胞（圖4），在支氣管及血管平滑肌細胞亦有較弱的表達，肺泡腔未見有明顯陽性表達細胞（圖5）。模型組支氣管上皮細胞表達相對減弱（圖6），在Tie?2陽性的炎癥細胞附壁區域，內皮細胞Tie?2表達增強（圖7），在肺泡間隔及肺泡腔內中性粒細胞及巨噬細胞均有強陽性的表達（圖8），平滑肌細胞表達未見明顯差別。
3 討論
眾多肺內外因素均可引起ALI，其中sepsis是重要的肺外因素。CLP術由腸源性感染誘導sepsis致ALI，能較好的模擬疾病的自然病理生理過程。本實驗大鼠在CLP術后12 h肺臟病理變化以肺泡中隔變化為主，表現肺間質充血水腫，大量中性粒細胞及少量巨噬細胞浸潤，肺泡結構破壞，與國外的模型報道相符［2］。Tie?2廣泛表達于成人脈管系統中［3］，對維持正常血管完整性有重要作用。Tie?2配體包括Ang?1、Ang?2、Ang?4，其中Ang?1可以激動Tie?2，促進內皮細胞遷移，拮抗凋亡，募集血管周圍支持細胞，穩定血管，防止滲漏，Ang?2作用較復雜，通常認為可以抑制Tie?2，對血管起去穩定作用，但在體外實驗中高濃度或長時間刺激Tie?2時也可激動受體［4，5］，Ang?4可以激動Tie?2，但研究較少。最新的研究表明,Ang/Tie?2系統在炎癥反應內皮細胞活化中起重要作用［6］。
Lemieux等［7］通過RT?PCR、免疫組化及共聚焦顯微鏡首次發現Tie?2表達于中性粒細胞，且Ang?2可以較弱的激動中性粒細胞Tie?2。在內皮細胞Tie?2的活化可誘導P選擇素的定位，導致中性粒細胞粘附能力的增加，而中性粒細胞Tie?2活化可以進一步增強其粘附能力。本研究亦發現在Tie?2陽性的中性粒細胞附壁區域，內皮細胞Tie?2亦染色增強，提示兩者Tie?2可能同時存在活化現象。
Murdoch等［8］通過體外細胞實驗發現低氧血癥能上調單核細胞?巨噬細胞較強強度表達Tie?2，其中組織巨噬細胞有著最強的表達，推斷Ang?2可能趨化Tie?2陽性單核細胞的游走至炎癥區或腫瘤組織，易化血管新生。本研究亦發現肺泡巨噬細胞高強度的表達Tie?2，在大血管及支氣管粘膜下層亦有陽性表達Tie?2的巨噬細胞，這些細胞作用仍不清楚，是否與ALI損傷后組織修復有關有待進一步研究。
綜上所述，本研究表明ALI時肺組織中性粒細胞及巨噬細胞表達Tie?2，同時內皮細胞Tie?2表達增強，Tie?2參與了ALI的病變過程。
【參考文獻】
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［7］ Lemieux CR,Maliba J,Favier JF,et al.Angiopoietins can directly activate endothelial cells and neutrophils to promote proinflammatory responses［J］.Blood, 2005,105 (4):1523?1530.
［8］ Murdoch C,Tazzymans,Webster S,et al.Expression of Tie?2 by human monocytes and their responses to angiopoietin?2［J］.J Immunol, 2007,178(11):7405?7411.
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