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高氧對肺損傷患兒的影響研究
氧療是提高早產(chǎn)兒存活率的有效方法，但是長時間高濃度吸氧可導致肺損傷，下面是小編搜集的一篇關于高氧對患兒肺損傷影響探究的論文范文，供大家閱讀參考。
近年隨著科技的進步，越來越多的極度早產(chǎn)兒和極低出生體質(zhì)量兒幸存下來，但是由于長期吸入高濃度氧，患兒可發(fā)生肺損傷，嚴重者甚至發(fā)生支氣管肺發(fā)育不良(BPD)[1,2].目前，高氧性肺損傷的機制尚不清楚，最近研究的熱點主要集中在氧化應激方面[3,4],而NAD+依賴性的組蛋白去乙酰化酶(SIRT1)在氧化應激及DNA損傷修復中發(fā)揮重要作用[5].本研究在前期實驗基礎上，通過建立高氧損傷人肺泡上皮細胞(HPAEC)模型[6],探討SIRT1轉(zhuǎn)位是否介導肺泡上皮細胞發(fā)生凋亡，從而為減輕高氧肺損傷尋找新的治療靶點。
1材料與方法
1.1細胞、儀器及試劑HPAEC細胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。LX71型倒置相差顯微鏡購自Olympus公司，F(xiàn)ORMA311型CO2培養(yǎng)箱、胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司，ANNEXINV流式細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司，單克隆小鼠抗SIRT1抗體購自博士德生物公司，羅丹明標記山羊抗小鼠IgG購自ZSGB-BIO公司，DAPI購自碧云天生物公司，抗熒光淬滅封片液購自碧云天生物公司，單克隆小鼠抗SENP1抗體與單克隆抗乙�；痯53lys(382)抗體購自Abcam公司，ECL化學發(fā)光試劑購自北京普利萊基因技術有限公司。
l.2HPAEC細胞培養(yǎng)先將HPAEC細胞復蘇，加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，放入37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)生長期時，用0.25%的胰蛋白酶進行消化，傳代培養(yǎng)。
1.3HPAEC細胞分組及高氧干預取對數(shù)生長期的細胞，消化后傳代接種于培養(yǎng)瓶中，隨機分為高氧組、對照組。對照組不作處理，放置于50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);高氧組換液1次后，以3L/min的速度通入含900ml/LO2和50mL/LCO2高純混合氣，通入時間為10min,參照我們前期高氧模型建立的方法[6].分別培養(yǎng)24h(高氧組細胞干預24h后，使用測氧儀檢測培養(yǎng)瓶中氧濃度，如果氧濃度<90%則棄去該標本),之后收集HPAEC細胞。
1.4HPAEC細胞凋亡情況觀察兩組細胞培養(yǎng)24h后，收集細胞，用流式細胞儀檢測，按照凱基ANNEXINV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。
1.5HPAEC細胞形態(tài)學觀察倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化，并照相。
1.6HPAEC細胞SIRT1蛋白轉(zhuǎn)位情況觀察將HPAEC細胞消化后，按細胞密度為2×104/孔接種于6孔板中蓋玻片上培養(yǎng)，同步化細胞，兩組均加入1mL培養(yǎng)基，高氧組另通入高濃度氧，分別培養(yǎng)24h;多聚甲醛固定細胞10min;0.3%TritonX-100打孔10min;5%封閉血清在37℃封閉30min;將稀釋的抗體SIRT1(終濃度為1∶100)滴加在細胞爬片上，4℃冰箱孵育過夜，在避光情況下將羅丹明標記的山羊抗小鼠IgG(終濃度為1∶50),37℃濕盒中孵育60min;用PBS洗滌3次，滴加DAPI復染，免疫共聚焦顯微鏡下觀察并照相;每張細胞爬片截取5個視野，每組8張爬片，并照相，計算細胞轉(zhuǎn)位率。
1.7HPAEC細胞SENP1、乙�；痯53蛋白檢測采用Westernblotting法。兩組細胞培養(yǎng)干預24h(細胞生長80%融合),胰酶消化后PBS沖洗，離心并移去上清。加入200μL裂解混合液，冰浴30min,離心取上清，電泳、轉(zhuǎn)膜，加入一抗，再加入顯色的二抗，以TBST清洗，使用ECL進行結(jié)果的顯影，然后用Labworks4.6分析目的條帶的灰度值。
1.8統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2結(jié)果
高氧組和對照組細胞凋亡率分別為24.77%±2.17%、5.33%±2.60%,兩組比較，P<0.05.高氧組細胞從正常的長梭形、多角形變成圓形、橢圓形，細胞間的間隙增寬，懸浮的細胞較多;對照組細胞大多為長梭形、多角形，貼壁較好，細胞間的間隙較小，懸浮的細胞較少。高氧組和對照組細胞SIRT1蛋白轉(zhuǎn)位率分別為88.89%(96/108)、16.23%(25/154),兩組比較，P<0.05.高氧組和對照組細胞SENP1蛋白相對表達量分別為0.76±0.12、0.67±0.02,乙酰化p53蛋白相對表達量分別為0.81±0.07、0.52±0.03,兩組比較，P均<0.05.
3討論
近年來，早產(chǎn)兒的出生率逐年增高，早產(chǎn)兒中大部分會發(fā)生夭折，氧療是提高早產(chǎn)兒存活率的有效方法，但是長時間高濃度吸氧可導致肺損傷，從而導致BPD的發(fā)生[7].活性氧簇(ROS)增多所致的氧化應激損傷是早產(chǎn)兒高氧肺損傷發(fā)生的主要機制[8],而SIRT1蛋白能顯著降低ROS水平和促進細胞生存[9].
SIRT1蛋白是一種NAD+依賴性脫乙酰酶，作為哺乳動物生命周期相關蛋白，其主要功能是調(diào)節(jié)細胞氧化應激反應和調(diào)控生命周期。SIRT1蛋白主要定位于細胞核，在細胞能量代謝、DNA損傷修復、細胞周期控制、抑制細胞凋亡、抗氧化逆境和延長細胞壽命方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，是機體內(nèi)抗氧化應激的關鍵蛋白[10,11].Yang等[12]用紫外線輻射、過氧化氫誘導人肺腺癌細胞后發(fā)現(xiàn)，SIRT1蛋白可發(fā)生翻譯后修飾，在734位賴氨酸上發(fā)生小泛素樣修飾蛋白(SUMO)修飾。該修飾決定著SIRT1蛋白在細胞核的定位。這是一個動態(tài)的、可逆的過程，其去SUMO修飾的過程則由SENP1介導[13,14].SIRT1蛋白主要存在于細胞核，少量存在于細胞質(zhì)，當細胞應激時SIRT1蛋白能被SENP1去SUMO化，使p53蛋白的第382位賴氨酸殘基去乙�；瘻p少，抑制p53與靶DNA順式原件結(jié)合，進而抑制p53促凋亡活性[15~18].本研究顯示，高氧組細胞生長較差，細胞間隙增寬，懸浮細胞較多，細胞的凋亡率增加，這與我們的前期實驗[6]結(jié)果一致，即高氧可以誘導細胞凋亡。本研究還顯示，高氧組SENP1蛋白表達、SIRT1轉(zhuǎn)位率、乙�；痯53表達均較對照組升高，這與Yang等[12]結(jié)果一致。提示高氧可誘導細胞凋亡，其凋亡的機制與SIRT1蛋白相關。
總之，高氧誘導SENP1蛋白表達，促使SIRT1蛋白發(fā)生去SUMO化，發(fā)生核質(zhì)轉(zhuǎn)位，去乙�；钚詼p低，對p53去乙�；钚詼p低，乙�；痯53相對增加，從而激活下游的凋亡通路而介導細胞凋亡。
參考文獻：
[1]HilgendorffA,ReissI,EhrhardtH,etal.Chroniclungdiseaseinthepreterminfant.Lessonslearnedfromanimalmodels[J].AmJRespirCellMolBiol,2014,50(2):233-245.
[2]JinL,YangH,FuJ,etal.AssociationbetweenoxidativeDNAdamageandtheexpressionof8-oxoguanineDNAglycosylase1inlungepithelialcellsofneonatalratsexposedtohyperoxia[J].MolMedRep,2015,11(6):4079-4086.
[3]SchumackerPT.Lungcellhypoxia:roleofmitochondrialreactiveoxygenspeciessignalingintriggeringres-ponses[J].ProcAmThoracSoc,2011,8(6):477-484.
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