atRA對(duì)動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后平滑肌細(xì)胞CDKs表達(dá)影響

atRA對(duì)動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后平滑肌細(xì)胞CDKs表達(dá)影響

【摘要】  目的 探討全反式維甲酸（atRA）對(duì)受損大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDKs)表達(dá)的影響。方法 77只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、損傷組、atRA組，分別于術(shù)后2、7、14 d取實(shí)驗(yàn)動(dòng)脈段，測定內(nèi)膜、中膜平滑肌細(xì)胞CDK2、CDK4的表達(dá)水平。結(jié)果 損傷組CDK2、CDK4均于術(shù)后2 d在中膜表達(dá)，隨后表達(dá)漸少，損傷后7 d，在內(nèi)膜有表達(dá)，14 d內(nèi)膜表達(dá)呈強(qiáng)陽性，并可見向管腔表面聚集現(xiàn)象；atRA組CDK2陽性表達(dá)指數(shù)較損傷組顯著下降(t=4.97～17.86，P<0.01),CDK4陽性表達(dá)指數(shù)亦顯著下降(t=5.64～20.05，P<0.01)。結(jié)論atRA可能通過抑制CDK2、CDK4的過表達(dá)而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制內(nèi)膜增生。 
【關(guān)鍵詞】  維甲酸 創(chuàng)傷和損傷 動(dòng)脈 肌細(xì)胞 平滑肌 細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴激酶類
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effects of all?trans retinoic acid (atRA) on the expression of cyclin?dependent kinase （CDKs） after vascular injury. MethodsThe rats were randomly divided into sham operated group, injury group, and atRA group. The aortic tissues were taken on day 2, 7, and 14, respectively. Immunohistochemistry for CDK2 and CDK4 was performed at different times. Results Immunohistochemical analysis revealed expression of both CDK2 and CDK4 within the media of injured thoracic arteries at day 2. At day 7, expression of CDK2 and CDK4 declined to basal levels in the media but both were detected within the intimal lesion. By day 14, when a prominent intimal lesion formed, CDK2 and CDK4 were largely confined to the luminal surface. Less CDK2 (t=4.97-17.86，P＜0.01) and less CDK4 (t=5.64-20.05，P＜0.01) immunostaining were found in the atRA group than in the control group.ConclusionAtRA may inhibit the VSMC cell cycle by reducing the over?expression of CDK2 and CDK4 to inhibit intimal hyperplasia.
    ［KEY WORDS］tretinoin； wounds and injuries； arteries； myocytes, smooth muscle； cyclin?dependent kinases
    經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）術(shù)后，由于動(dòng)脈壁損傷及炎性反應(yīng)，刺激諸多細(xì)胞因子、生長因子產(chǎn)生，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增生并向內(nèi)膜遷移，支架內(nèi)再狹窄率可達(dá)15%～20%左右，影響PCI術(shù)后遠(yuǎn)期療效。刺激VSMC增生的分子機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)途徑是呈網(wǎng)絡(luò)狀分布的，僅抑制某一種因子并不能有效抑制VSMC增生，尋求VSMC增生最后的共同途徑，才是有效抑制VSMC增生的最佳途徑，細(xì)胞周期可能就是這樣一種最終的共同的途徑。全反式維甲酸（atRA）具有影響細(xì)胞生長、凋亡、分化與移行等廣泛的生物學(xué)作用,因此亦可能對(duì)某些血管疾病有治療價(jià)值。本文通過分析atRA對(duì)球囊損傷大鼠胸主動(dòng)脈后平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDKs)表達(dá)的影響，探討atRA用于防治PCI術(shù)后再狹窄的機(jī)制。
    1  材料與方法
    1.1  材料
    atRA為上海第六制藥廠產(chǎn)品；CDK2單克隆抗體（工作液）為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品；CDK4單克隆抗體（工作液）、免疫組化通用SP試劑盒為美國ZYMED公司產(chǎn)品；VIDAS 21圖像分析系統(tǒng)為德國蔡氏公司產(chǎn)品；自制2F球囊導(dǎo)管。Wistar大鼠購自北京大學(xué)心血管病基礎(chǔ)研究所。
    1.2  方法
    1.2.1  動(dòng)物分組  77只健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量350～450 g（均于術(shù)前4 d至處死給予植物油灌胃），隨機(jī)分為3組。假手術(shù)組（n=11）：除不插入球囊導(dǎo)管外，余操作均同損傷組，術(shù)后14 d處死；損傷組：按球囊損傷術(shù)后處死時(shí)間又分為術(shù)后2、7、14 d等3個(gè)亞組，每個(gè)亞組11只；atRA組：亦分為術(shù)后2、7、14 d等3個(gè)亞組，每個(gè)亞組11只，術(shù)前4 d至處死給予atRA（30 mg·kg-1·d-1）灌胃。
    1.2.2  動(dòng)物模型制作  參照劉乃奎等［1］的方法，將大鼠用6 g/L戊巴比妥鈉（5 mL/kg腹腔內(nèi)注射）麻醉后，經(jīng)左頸總動(dòng)脈插入2F球囊導(dǎo)管至腹主動(dòng)脈處，注入0.1 mL生理鹽水?dāng)U張球囊，回拉至頸總動(dòng)脈分叉處，反復(fù)3次，將導(dǎo)管旋轉(zhuǎn)180°，再反復(fù)回拉3次，拔出導(dǎo)管，結(jié)扎縫合切口，常規(guī)飼養(yǎng)。術(shù)前1 d及術(shù)后3 d每只大鼠給予青霉素10萬單位腹腔內(nèi)注射預(yù)防感染。
    1.2.3  標(biāo)本制備  將大鼠處死后，快速摘取胸主動(dòng)脈，連續(xù)剪取3段2.5 mm長的血管，去除外膜內(nèi)疏松結(jié)締組織，置于中性甲醛緩沖液固定24 h，經(jīng)石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，每段血管標(biāo)本取3張切片，采用SP法，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟分別進(jìn)行CDK2、CDK4免疫組化染色。光鏡下觀察免疫組化切片，胞核呈棕色為陽性。每只大鼠每個(gè)指標(biāo)觀察9張切片，VIDAS 21圖像分析系統(tǒng)隨機(jī)測量每張切片中10個(gè)視野(400倍)陽性細(xì)胞的平均吸光度及平均陽性細(xì)胞百分率，取其均數(shù)，用兩者乘積再乘以100作為陽性表達(dá)指數(shù)，來表示蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
    1.2.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析  數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。組間比較采用t檢驗(yàn)。
    2  結(jié)    果
    假手術(shù)組CDK2、CDK4表達(dá)均呈陰性反應(yīng)。損傷組CDK2、CDK4均于術(shù)后2 d在中膜散在陽性表達(dá)；術(shù)后7 d，CDK2、CDK4在新生內(nèi)膜呈陽性表達(dá)，中膜則少或無表達(dá)；術(shù)后14 d，CDK2、CDK4隨內(nèi)膜進(jìn)一步增厚均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，且有向管腔表面聚集的趨勢。atRA組與損傷組比較，中膜（2、7 d）或內(nèi)膜（7、14 d）CDK2的陽性表達(dá)均明顯減少(t=4.97～17.86,P<0.01)；CDK4的陽性表達(dá)亦均明顯減少（t=5.64～20.05,P<0.01）。見表1。表1  atRA對(duì)球囊損傷大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮后平滑肌細(xì)胞CDKs陽性表達(dá)指數(shù)的影響與損傷組相應(yīng)時(shí)間比較，*t=4.97～17.86,P<0.01；△t=5.64～20.05,P<0.01
    3  討    論  
　  血管內(nèi)皮損傷后，VSMC向內(nèi)膜的遷移、增生是再狹窄的主要病理機(jī)制［2,3］。抑制平滑肌細(xì)胞增生和向內(nèi)膜遷移是預(yù)防血管成形術(shù)后再狹窄的重要手段。
    CDKs是一種蛋白激酶家族，是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)重要分子，它們通過磷酸化?脫磷酸化調(diào)節(jié)一系列靶分子的活性，最終導(dǎo)致DNA的復(fù)制和有絲分裂。研究發(fā)現(xiàn)，atRA能維持并誘導(dǎo)VSMC處于較高水平的分化狀態(tài)，抑制VSMC遷移和增殖［4］。CDK?cyclin復(fù)合物的周期性聚集、激活和解聚可驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)，CDK是復(fù)合物的催化亞基，而cyclin是調(diào)節(jié)亞基。cyclinE?CDK2、cyclinA?CDK2和cyclinD?CDK4共同參與G1期和S期的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因(Rb)磷酸化，使E2F釋放，增加轉(zhuǎn)錄RNA的速度，促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期過渡［5］。KOSOKA等［6］采用細(xì)胞培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn),atRA對(duì)cyclinE、cyclinD3、CDK4、CDK6、CDK2等多種基因有抑制作用，從而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。劉國霞等［7］應(yīng)用免疫組化和電子顯微鏡觀察的方法研究atRA對(duì)原代培養(yǎng)的人腹主動(dòng)脈VSMC增殖的影響，發(fā)現(xiàn)atRA使VSMC的增長速度減慢，經(jīng)atRA處理的細(xì)胞中cyclinD1、CDK4的表達(dá)分別降低了39%和38%，c?myc基因的表達(dá)水平降低了43.6%。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CDK2、CDK4在正常動(dòng)脈壁血管組織中表達(dá)量甚微或無；球囊損傷術(shù)后2 d其均呈陽性反應(yīng)，陽性細(xì)胞在中膜散在表達(dá)；術(shù)后7 d新生內(nèi)膜形成，均在內(nèi)膜表達(dá)，中膜則少或無表達(dá)；術(shù)后14 d隨內(nèi)膜進(jìn)一步增厚，表達(dá)局限于內(nèi)膜，均呈強(qiáng)陽性，且有向管腔表面聚集的趨勢，這與WEI等［8］的報(bào)道相一致。其變化規(guī)律與形態(tài)學(xué)表現(xiàn)相一致，說明CDK2、CDK4的表達(dá)是對(duì)球囊損傷的一種反應(yīng)，CDK2、CDK4的過度表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞周期的影響是發(fā)生再狹窄的機(jī)制之一。atRA使中膜（2、7 d）和內(nèi)膜（7、14 d）的CDK2、CDK4陽性表達(dá)均明顯少于損傷組，說明atRA可能通過抑制G1期CDK2、CDK4的表達(dá)而影響CDK4與cyclinD的結(jié)合，影響CDK2與cyclinD、cyclinE在晚G1和早S期的結(jié)合，從而抑制G1→S期進(jìn)程；通過抑制S期CDK2的表達(dá)，影響CDK2與cyclinA在S期的結(jié)合，從而抑制DNA的合成。
    CDK2可作為血管成形術(shù)后再狹窄防治中的靶基因［8］。MORISHITA等［9］合成了CDK2的反義寡核苷酸，以病毒HVU?脂質(zhì)體為介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染到大鼠損傷頸動(dòng)脈，轉(zhuǎn)染2周即發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜增生被顯著抑制（抑制率達(dá)60%）。SUZUKI等［10］亦證實(shí)HVJ?脂質(zhì)體介導(dǎo)的CDK2反義寡核苷酸對(duì)移植冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜增生有抑制作用。TAKAGI［11］發(fā)現(xiàn)，腺病毒誘導(dǎo)的CDK抑制物p57kip2的過度表達(dá)可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，且VSMC大部分停留在G1期，亦提示CDKs可作為血管成形術(shù)后再狹窄防治中的靶基因。
    然而，單獨(dú)針對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的治療可能并不能治療人類復(fù)雜的血管栓塞性疾病，仍需從不同的角度進(jìn)一步研究、探討維甲酸對(duì)PCI術(shù)后再狹窄的防治作用及其機(jī)制。
 
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