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全反式維甲酸對兔頸動脈粥樣硬化病灶VSMC增殖及AKT1表達影響
作者：張青青 董果雄 張社華
【摘要】 目的 探討全反式維甲酸(atRA)對兔頸動脈內膜損傷后內膜增生以及蛋白激酶B(AKT1)、增殖細胞核抗原（PCNA）表達的影響和機制。方法 新西蘭雄性大白兔36只，隨機分為6組：假手術A、B組,手術A、B組,手術并予atRA治療A、B組（治療A、B組），每組各6只。各組均給予高脂飲食14 d后，手術組作頸動脈內膜損傷模型。治療組于術前3 d開始每天給予atRA灌胃，其余操作同手術組。假手術組手術但不損傷內膜。于術后7 d處死A組動物， 28 d處死B組動物。采取頸動脈標本，對血管粥樣硬化病變進行大體形態(tài)學觀察，用免疫組化法檢測粥樣硬化病灶中AKT1、PCNA的表達水平。結果 手術組術后7 d內膜開始增生， 28 d時增生明顯，粥樣斑塊形成，管腔狹窄，AKT1、 PCNA陽性表達明顯。治療組內膜增生較輕， 28 d時，內膜面積及斑塊厚度低于手術組(t=3.797、3.704,P<0.01)，AKT1、PCNA陽性表達指數(shù)亦低于手術組(t=4.741、2.890,P<0.05)。結論atRA能抑制兔頸動脈內皮損傷后AKT1、PCNA的表達，抑制平滑肌細胞增殖，從而抑制內膜增生及動脈粥樣硬化病變進程。
【關鍵詞】 維甲酸；肌細胞,平滑�。还跔顒用}再狹窄；原癌基因蛋白質c?akt
�。跘BSTRACT］ Objective To investigate the influence of all?trans retinoic acid (atRA) on intima proliferation and expressions of AKT1 and PCNA in rabbit carotid artery after endomembrane injury. Methods Thirty?six New Zealand rabbits wereevenly randomized to six groups: sham?operation group A and group B; operation group A and group B; and treatment group A and group B. All the rabbits were fed with high fat diet for 14 days. A model of carotid artery endomembrane injury was created in operation group. In treatment groups, rabbits were lavaged with atRA daily for 3 days before operation. Those in sham?operation groups underwent surgery without injuring the endomembrane. Rabbits in groups A were killed 7 days after operation and those in groups B, 28 days. Carotid specimens were taken for gross examination and immunohistochemistry study used for detection of the expressions of AKT1 and PCNA proteins. Results Seven days after operation, neointima formation was found in carotid artery in the operation group, and it became obvious afetr 28 days with atherosclerosis plaque, narrowing of arterial lumen and expressions of AKT1 and PCNA. In the treatment group, there was mild intima proliferation, and, 28 days after surgery, the intima area was smaller and the plague was thinner than that of the operation group (t=3.797, 3.704;P<0.01). The index of positive expressions of AKT1 and PCNA in the treatment group was also lower than that of the operation group (t=4.741, 2.890;P<0.05). Conclusion atRA can suppress the expressions of AKT1 and PCNA in injured endomembrane of rabbit carotid artery, inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells, and therefore inhibit neointima proliferation and progression of atherosclerosis.
［KEY WORDS］ tretinoin; myoblasts, smooth muscle; coronary restenosis; proto?oncogene proteins c?akt
經(jīng)皮冠狀動脈成形術(PTCA)及支架植入術已被廣泛用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的治療，然而其術后的再狹窄（RS）問題影響了其遠期療效。再狹窄是受損內膜增生的表現(xiàn),其主要病理機制則是血管平滑肌細胞（VSMC）的過度增殖。全反式維甲酸(atRA)是維生素A的天然衍生物，近年來研究發(fā)現(xiàn)它可抑制VSMC的表型轉化、遷移，調節(jié)細胞內信號轉導通路及細胞周期進程，從而影響新生內膜形成的多個環(huán)節(jié)[1?2]。蛋白激酶B(AKT1)是細胞內信號轉導通路中重要的信號分子，調控細胞多種基本功能，尤其在細胞增殖和存活方面發(fā)揮著關鍵作用。本文旨在進一步探討atRA抑制VSMC增生、預防RS發(fā)生的機制，為臨床選藥提供依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 動物分組及模型制作
新西蘭雄性大白兔36只，青島市動物實驗中心提供，4月齡，體質量（2.50±0.12）kg。隨機分為6組：治療A組，治療B組，手術A組，手術B組，假手術A組，假手術B組。治療組和手術組每日進食150 g高脂飼料（每100 g飼料含豬油 6.0 g,膽固醇1.5 g,基礎飼料92.5 g。），假手術組每日進食150 g基礎飼料，均自由飲水。各組動物飼養(yǎng)14 d后在無菌操作下進行手術：手術組行頸動脈內膜空氣干燥術，治療組于術前3 d開始給予atRA(重慶華邦制藥公司) 6 mg·kg-1 ·d-1灌胃，其余操作同手術組。假手術組分離頸動脈但不損傷內膜。各組術后每天肌注青霉素40萬單位，連續(xù)3 d。分別于術后7 d時處死A組動物，28 d時處死B組動物，取病變部位血管等距切分4～5段，40 g/L中性緩沖甲醛固定，石蠟包埋，血管標本橫截面切片(3 μm)。
1.2 血管形態(tài)學及動脈粥樣硬化病變檢測
術后取出血管段，先進行大體肉眼觀察。蠟塊標本切片行蘇木精?伊紅染色（HE染色），顯微鏡下觀察血管結構，采用圖像分析軟件Image?Pro Plus(IPP)進行圖像分析，測定各個血管截面的內膜面積(IA)、中膜面積(MA)，計算內膜/中膜面積比（I/M)、管腔狹窄度(LSD)。LSD =內膜面積/內彈力板下面積×100％，取平均值。取術后28 d切片，顯微鏡下觀察動脈粥樣硬化病變情況，根據(jù)AHA對動脈粥樣硬化的分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)計數(shù)每期發(fā)生動物例數(shù)，以最重病變?yōu)闇�，測量動脈粥樣硬化病變最厚處內彈力板至腔面垂直距離，作為該動物的最大斑塊厚度。
1.3 AKT1和增殖細胞核抗原(PCNA)表達檢測
采用免疫組織化學二步法行AKT1（即用型兔抗兔AKT1，武漢博士德公司)免疫組化反應，工作液未做稀釋，二抗采用PV?6001試劑盒(北京中杉公司)，DAB顯色，蘇木精復染，胞質呈棕黃、棕褐色為陽性。以PBS代替一抗作陰性對照。用IPP進行圖像分析，隨機測量每張切片中6個高倍視野的陽性部位平均吸光度（A）和陽性面積百分比，取其平均值。AKT1陽性表達指數(shù)=平均吸光度（A）×平均陽性面積百分比×100。用二步法進行鼠抗兔PCNA（北京中杉公司）染色，一抗稀釋度為1∶100，顯色步驟同AKT1。采用IPP進行圖像分析，隨機測量每張切片6個高倍視野的陽性胞核占總胞核比例及陽性胞核平均光吸光度（A），計算PCNA陽性表達指數(shù)。PCNA陽性表達指數(shù)=平均陽性胞核比×平均吸光度（A）×100。
1.4 統(tǒng)計學處理
使用SPSS 13.0和PPMS 1.5[3]統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料結果以±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用等級分組資料H檢驗。
2 結 果
2.1 肉眼觀察
所有動物無患病、死亡。術后未發(fā)現(xiàn)感染，創(chuàng)口愈合良好。假手術A、B組內膜光滑。手術A組內膜可見脂點、脂紋及斑塊，B組內膜明顯增厚，表面不平整，斑塊長短不一，隆起于內膜表面。atRA治療A組內膜可見有脂點、脂紋形成，B組內膜可見斑塊形成但較手術B組輕。
2.2 光學顯微鏡觀察
假手術A、B組動脈內皮細胞結構完整,單層規(guī)則排列，緊貼于內彈力板；內彈力板結構完整，中膜層厚度均勻，基質勻稱，VSMC呈環(huán)形規(guī)則排列，胞內可見梭形的細胞核，排列方向一致，兩組無明顯差異。手術A組管腔內皮開始增生，多為單層內皮細胞，局部呈多層，內彈力板模糊，多處可見斷裂，平滑肌細胞穿過內彈力板，中膜層間隙增寬，細胞外基質增多，細胞數(shù)增多，排列紊亂，內彈力板下尤為明顯；手術B組管腔內凹凸不平，粥樣斑塊向管腔隆起，內皮下可見脂質池形成，內膜增厚明顯，內皮細胞大量增生，泡沫細胞形成，平滑肌細胞增生移行明顯。atRA治療組與手術組病理變化相似，治療A組可見有內皮增生，內彈力板有斷裂，較手術A組輕；治療B組內膜增厚程度、平滑肌細胞增生移行程度較手術B組亦輕。
2.3 各組IA、I/M和LSD比較
治療A組IA、I/M、LSD與手術A組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.498～1.446,P>0.05）；治療B組IA、I/M、LSD均低于手術B組（t=3.797～ 6.893,P<0.01）。見表1。表1 各組IA、MA、I/M及LSD值比較（略）
2.4 各組動脈粥樣硬化病變情況比較
術后28 d時手術組有1例觀察到Ⅰ期病變，5 例觀察到Ⅱ期病變；治療組有5例觀察到Ⅰ期病變，1例觀察到Ⅱ期病變，治療組病變較手術組輕，差異有顯著性(H=4.89，P<0.05)。斑塊厚度手術組為(0.19±0.06)mm，治療組為(0.09±0.03)mm，兩組比較，差異有顯著性(t′=3.704，P<0.01)。
2.5 各組AKT1、PCNA 表達的比較
假手術A、B組AKT1僅在血管內皮細胞胞質有微量表達；手術A組AKT1在內膜增生處內膜層和中膜層高度表達，內皮細胞、平滑肌細胞及泡沫細胞的胞質、胞核均有表達，主要表達于胞質；手術B組AKT1陽性表達指數(shù)在增生內膜層與中膜層均下降，以粥樣斑塊深面內彈力板周圍表達明顯；治療A、B組AKT1表達規(guī)律與手術組相同，但AKT1的陽性表達指數(shù)低于手術組，差異均有極顯著意義（t=5.180、3.361，P<0.01）。假手術組偶見微量PCNA表達；手術組PCNA在新生內膜和中膜強表達，主要表達于細胞核；治療組PCNA表達部位及規(guī)律與手術組一致，但治療A、B組PCNA陽性表達指數(shù)均低于手術A、B組（t=4.741、2.890，P<0.01、0.05）。見表2。表2 各組AKT1和PCNA陽性表達指數(shù)比較（略）
3 討 論
RS的主要機制之一就是VSMCs的過度增殖。抑制VSMCs異常增殖成為預防RS的主要手段。近年來研究發(fā)現(xiàn)，atRA對PTCA術后VSMCs具有明顯抑制作用，是一種很有前景的防治RS發(fā)生的藥物。本課題組前期實驗證實，atRA可抑制平滑肌細胞的增殖。本實驗的目的是進一步研究atRA抑制細胞增殖的機制。
組織的穩(wěn)態(tài)是內環(huán)境中各種因素影響細胞的增殖活動和凋亡活動，使兩方處于動態(tài)平衡的結果。任何一方面被過度激活或抑制都會打破這個平衡，使組織表現(xiàn)為增殖或者凋亡。因此，VSMCs的增殖和凋亡與RS的發(fā)生發(fā)展密切相關。抑制平滑肌細胞的增殖和促進其凋亡成為目前防治血管異常增生性疾病的兩個重要手段。而在調控細胞生物活動尤其是增殖和凋亡的復雜的信號轉導網(wǎng)絡中AKT起到了樞紐作用。
AKT又稱作PKB（蛋白激酶B），屬于絲?蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內重要信號分子，PI3K是主要調節(jié)AKT活性的物質，因此AKT主要參與PI?3K?AKT信號轉導通路，通過影響下游多種效應分子的活化狀態(tài)在細胞多種生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。哺乳動物AKT至少包括3種亞型：AKT1、AKT2、AKT3，研究表明其與細胞增殖、存活、分化、凋亡、遷移等多種生物學活動有關。其中，AKT1主要促進細胞存活和增殖。PI?3K?AKT途徑可以被多種細胞內的刺激因子以及有毒物質，如PDGF、VEGF、IGF?1、AngⅡ、eNOS等所活化,并可促使其遷移至細胞核內。AKT的異常活化與多種疾病的發(fā)展有關，尤其是增殖性疾病如腫瘤，其實質是細胞增殖與凋亡失去平衡，而正是AKT途徑聯(lián)系了這兩個事件，而且起到了主要的作用，這種作用表現(xiàn)為負性調節(jié)細胞凋亡，正性調節(jié)細胞增殖。一方面，AKT具有抗細胞凋亡的作用�；罨腁KT可以使BAD（Bcl?2家族）、BAX（Bcl?2家族）、caspase?9、 Par?4磷酸化，發(fā)揮抗凋亡作用[4?6]；影響轉錄因子家族Forkhead、NF?κB、P53等，發(fā)揮細胞存活調控作用[7]；另外，AKT還通過代謝途徑調節(jié)細胞凋亡。另一方面，AKT具有促進細胞增殖作用，其主要通過調控細胞周期實現(xiàn)。AKT可以與P21、P27結合并將其磷酸化，使P27水平下降，阻斷其抑制cyclin?E及CDK2作用。AKT還可以在S2／M期活化cyclin?B／CDC2。另外，AKT還通過磷酸化mTOR促進增殖相關基因mRNA的大量轉錄，合成生長增殖所需蛋白，加速細胞的增殖[8]。提示AKT在調節(jié)細胞增殖方面發(fā)揮著重要作用，其在細胞內高表達提示細胞處于過度增殖狀態(tài)。
本實驗結果顯示，AKT1在正常兔頸動脈僅內皮細胞胞質少量表達,平滑肌細胞不表達；高脂飲食和內膜損傷7 d后，內膜層內皮細胞、平滑肌細胞和中膜層平滑肌細胞均大量表達；28 d后，內膜層和中膜層表達雖均有所下降，但陽性表達指數(shù)仍較高。PCNA的表達規(guī)律與其相同，而PCNA則是反映細胞增殖程度的可靠指標。由此可見，AKT1的表達與VSMCs的過度增殖密切相關，可能是調控VSMCs增殖的主要信號分子。本文研究結果還顯示，治療B組與手術B組比較，IA、I/M、LSD以及最大斑塊厚度均有明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義。說明atRA可下調內膜增生血管內膜層以及中膜層平滑肌細胞AKT1及PCNA的表達。提示atRA具有抑制內膜損傷后增生，抑制動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展的作用。這種抑制作用可能與其抑制AKT1的表達，從而抑制平滑肌細胞過度增殖有關。
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