IL?6對NIH3T3細胞MMP?3和TIMP?1表達影響
作者：蘇萌 鄒云雯 褚言琛 楊堃
【摘要】 目的 探討白細胞介素?6(IL?6)對小鼠NIH3T3成纖維細胞中基質金屬蛋白酶?3(MMP?3)、金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP?1)表達的影響。方法 應用不同濃度(0、5、10、15、20 mg/L)的IL?6刺激NIH3T3成纖維細胞，共同培育12 h收集細胞。應用Western blot和 RT?PCR方法分別檢測細胞內MMP?3和TIMP?1的表達。結果 MMP?3表達隨著IL?6濃度的升高而上升，TIMP?1表達隨著IL?6濃度的升高而下降。結論 IL?6能影響MMP?3和TIMP?1的表達平衡，可能是影響硬膜外瘢痕形成的機制之一。
【關鍵詞】 白細胞介素6;瘢痕;基質溶解素1;金屬蛋白酶1組織抑制劑
[ABSTRACT] Objective To study the affect of IL?6 on the expressions of MMP?3 and TIMP?1 in NIH3T3 fibroblasts in mice. Methods Different concentrations (0,5,10,15 and 20 mg/L) of IL?6 were applied to stimulate NIH3T3 fibroblasts and culture for 12 h and collect the cells. Western bolt and RT?PCR were employed to detect the expressions of MMP?3 and TIMP?1 within the cells. Results The expression of MMP?3 increased with the rising concentration of IL?6,and TIMP?1 declined. Conclusion IL?6 can affect the balance between the expressions of MMP?3 and TIMP?1, which is, probably, one of the mechanisms of epidural scar formation.
[KEY WORDS] interleukin?6; cicatrix; stromelysin 1; tissue inhibitor of metalloproteinase?1
大量研究表明，硬膜外瘢痕增生被認為是腰椎手術失敗綜合征(FBSS)的重要原因[1]。硬膜外瘢痕則是由于細胞外基質(ECM)的異常沉積所致。基質金屬蛋白酶?3(MMP?3)能降解ECM，其活性受到金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP?1)的抑制，兩者在瘢痕形成中起著重要的作用[2]。本研究應用炎癥因子白細胞介素?6(IL?6)刺激小鼠NIH3T3成纖維細胞，觀察其中MMP?3和TIMP?1表達的改變，從而探討IL?6在瘢痕形成中的作用機制。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 細胞 小鼠NIH3T3成纖維細胞(購于中國科學院上海細胞庫)。
1.1.2 試劑 IL?6(Sigma公司)，兔抗小鼠MMP?3單抗(Bioworld公司)，兔抗小鼠TIMP?1多抗(Bioworld公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔二抗(Santa Cruz Biotechnology 公司)，TRIZOL、RT?PCR kit(TaKaRa公司)。
1.1.3 主要儀器 恒溫培養箱(Thermo Forma，USA);倒置顯微鏡(Olympus,Japan); Western電泳儀;轉膜儀(Bio?Rad，USA);PCR擴增儀(Eppendorf,Germeny);VILBER LOURMAT紫外線凝膠成像系統(France)。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養 細胞在37 ℃、體積分數為0.05 CO2的培養箱中培養，實驗用第5～8代細胞，將細胞按照1×108/L接種于6孔培養板中，待細胞貼壁融合達到80%～90%時，換無血清的DMEM培養液繼續培養18 h，然后加入不同質量濃度(0、5、10、15、20 μg/L)的IL?6刺激小鼠NIH3T3成纖維細胞12 h，收集細胞。
1.2.2 Western blot檢測 細胞干預完畢后，加入細胞裂解液冰上裂解30 min，離心收集上清液，變性的蛋白樣品經100 g/L分離膠電泳，恒流轉膜至PVDF膜，封閉過夜，一抗分別用兔抗鼠MMP?3單抗和兔抗小鼠TIMP?1多抗，室溫孵育60 min,二抗用HRP標記的羊抗兔抗體，室溫孵育60 min, ECL發光劑作用后曝光顯影。再用Striping buffer清除 PVDF膜上已結合的一抗和二抗，重新經β?Actin一抗、二抗孵育后，再次顯像，作為內部參照。
1.2.3 RT?PCR 將收集到的細胞按照TaKaRa試劑說明書采用細胞總RNA TRIzol試劑提取RNA，用紫外線分光光度計和凝膠電泳檢測其濃度和純度。MMP?3上游引物序列：5′?GAGTGTGGA?TTCTGCCATTGAAA?3′，下游引物序列：5′?GCA?AAGGAGATCATTATGTCAGCC?3′;GAPDH的上游引物序列：5′?GCATTGTGGAAGGGCTCA?3′，下游引物序列：5′?GGGTAGGAACACGGAAGG?3′;TIMP?1上游引物序列:5′?CAGTAAGGCCTGTA?GCTGTGCC?3′，下游引物序列：5′?TGTAGGCGTACCGGATATCTGC?3′。反應條件：94 ℃預變性5 min;然后94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s，擴增35個循環;最后72 ℃延伸10 min。取擴增產物電泳后，溴化乙錠顯色后分析。
1.3 統計學處理
對所得結果利用圖像分析系統進行灰度分析，將目的條帶吸光度值同相應內參進行比較，所得比值以±s表示，采用SPSS 11.0統計軟件進行處理，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有顯著性。
2 結 果
2.1 Western blot檢測
在實驗劑量范圍內MMP?3的表達隨著IL?6濃度的升高而升高，TIMP?1的表達隨著IL?6濃度的升高而下降，差異具有統計學意義(F=186.049、2 145.536，q=2.812～118.686，P<0.05)。見圖1、表1。
2.2 RT?PCR檢測
以GAPDH為內參校正后，不同濃度的IL?6均上調MMP?3的表達和下調TIMP?1的表達，并且在實驗劑量范圍內MMP?3的表達隨著IL?6濃度的加大而升高，TIMP?1的表達隨著IL?6濃度的加大而下降，差異具有統計學意義(F=296.023、8 180.845，q=4.672～204.382，P<0.05)。見圖2、表2。
3 討 論
椎板切除術是脊柱外科最常采用的手術方式，用來治療腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥和腰椎管內腫瘤等脊柱疾病。FBSS是椎板切除術后最常見的術后并發癥之一，發病率平均為5%～10%[3]。硬脊膜周圍纖維化和瘢痕形成被認為是導致FBSS表1 不同濃度IL?
6刺激小鼠NIH3T3成纖維細胞后MMP?3和TIMP?1蛋白表達表2 不同濃度IL?6刺激小鼠NIH3T3成纖維細胞后對MMP?3和TIMP?1 mRNA表達影響的重要的病理機制。SONGER等[4]于1990年提出了纖維化形成的三維立體學說，認為硬膜周圍的纖維化既來自于后方損傷的骶脊肌，也來自前方的纖維環和后縱韌帶，同時側方的粘連也導致神經根受累,這一觀點目前被大多數專家所接受和認可。目前臨床最常用治療措施是局部或全身應用類固醇激素，利用一些半流質或膜性物質作為物理或化學屏障隔斷瘢痕與硬脊膜和神經根的接觸，以此來預防硬膜外瘢痕形成;但通過動物實驗以及長期臨床觀察結果顯示，其不能有效預防硬膜外瘢痕的形成和FBSS的發生，而且需要延長手術時間和增加病人的失血量[5?6]。因此，利用細胞因子影響膠原的產生和代謝是防治病理性瘢痕的重要方法。瘢痕主要是由ECM大量沉積所致，ECM的主要成分是膠原，膠原蛋白的異常合成和沉積是導致局部纖維化和瘢痕形成的基礎。MMPs是一組參與ECM降解的蛋白酶，其活性受到TIMPs的抑制。MMP?3能降解多種基質蛋白，包括蛋白多糖、纖維連接蛋白、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原，更為重要的是它能激活MMP?1,使其降解膠原的活性升高7～10倍，變為超活性基質金屬蛋白酶(SA?MMP?1),并且還能激活MMP?7、MMP?8、MMP?9和MMP?10，從而降解膠原[7?8]。TIMPs是一組抑制MMPs活性的糖蛋白，有TIMP?1、TIMP?2、TIMP?3和TIMP4等4種類型[2]。TIMP?1 能高親和性以1∶1結合到MMPs形成復合體，抑制MMP?1、MMP?2、MMP?3活性，促進膠原的沉積[9]。IL?6是一種多效能的內分泌調節因子，本實驗結果顯示IL?6能劑量依賴性上調MMP?3表達和下調TIMP?1的表達。膠原酶和MMP?3的低表達是增生性瘢痕組織內ECM過度沉積的重要原因[5]。有報道瘢痕成纖維細胞低表達MMP?3，通過基因轉染技術將MMP?3的基因導入瘢痕成纖維細胞后，對ECM的降解力增強，說明MMP?3低表達是增生性瘢痕組織內ECM沉積的重要原因[10]。也有報道稱在病理性瘢痕中，MMP?1和TIMP?1均高表達，但TIMP?1相對表達量更高[11]。一些研究結果表明,MMPs和TIMPs表達以及酶活性的異常與創面的不正常愈合有密切的關系，MMPs的表達明顯升高會導致創面的不愈合,表達過低會導致瘢痕形成[12]，如何能在創面中平衡MMPs和TIMPs的表達將是預防和治療瘢痕的重要手段。
本文實驗結果提示，IL?6是能上調體外培養的NIH3T3細胞MMP?3的表達和抑制TIMP?1表達的細胞因子之一，這為我們進一步研究抗瘢痕形成機制和臨床應用抗瘢痕藥物提供了理論依據。但本實驗僅是體外簡單的細胞模型，并不能代表生理狀況下人體內復雜的抗瘢痕形成機制，對于抗瘢痕形成的復雜機制還需要進一步研究。
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