大劑量維生素C對外周血細胞活性的影響
作者：薛美蘭 張秀珍 馬愛國 姜秀波 張金玉
【摘要】 目的 觀察大劑量維生素C（VC）對外周血淋巴細胞增殖活性、抗DNA氧化損傷能力以及紅細胞膜流動性的影響。方法 將48只Wistar大鼠隨機分為對照組、A、B、C共4組，分別給予含VC為0、2 000、5 000、10 000 mg/kg的飼料，實驗期為8周。實驗結束后無痛處死動物并取血，測定血漿VC、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量，紅細胞膜谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?Px）活性、紅細胞膜流動性、淋巴細胞增殖活性，單細胞凝膠電泳計數彗星細胞測量DNA氧化損傷水平。結果 與對照組比較，A組血漿SOD活性明顯增高（F=2.987,q=4.24，P<0.05），血漿MDA含量明顯降低(F=4.176,q=4.23，P<0.05)，紅細胞膜流動性和外周血淋巴細胞增殖活性均明顯增高（F=2.278～2.763,q=3.67-3.84，P<0.05）；C組的血漿VC含量明顯升高（F=3.235,q=4.63，P<0.01），SOD和紅細胞膜GSH?Px活性明顯降低（F=2.987、3.478,q=3.68～4.13，P均<0.05），MDA含量明顯增高（q=4.08，P<0.05）。10 μmol/L H2O2誘發DNA損傷B組和C組較對照組均加重（F=4.137,q=3.94、4.25，P<0.05）。結論 較高劑量VC（2 000 mg/kg）可明顯增高大鼠機體的抗氧化損傷水平，改善紅細胞膜流動性，提高淋巴細胞的增殖活性；當VC劑量超過5 000 mg/kg時，反而會加重淋巴細胞的DNA氧化損傷。
【關鍵詞】 抗壞血酸；超氧化物歧化酶；膜流動性；淋巴細胞活化；DNA損傷
維生素C（VC）是一種水溶性維生素，具有抗氧化活性。一般認為VC是水溶性的，不能在體內蓄積，攝入較高劑量不會對機體產生危害。已知超大劑量服用VC會產生副作用，包括胃脹氣、腹瀉、嘔吐等。有一項體外研究指出，VC抗氧化作用與其劑量有密切關系[1]，過大劑量的VC（0.5 mmol/L）可能增加細胞DNA對H2O2或其他有害物質損害的敏感性。目前，健康機體攝入高劑量的VC是否有不良影響尚無定論。本實驗通過體內實驗對大鼠進行超出生理需要量數倍的大劑量VC干預，觀察大劑量VC對健康幼年大鼠外周血淋巴細胞增殖活性和抗DNA氧化損傷能力以及紅細胞膜流動性的影響及其可能機制�，F將結果報告如下。
1 材料與方法
1.1 動物分組及處理
幼年Wistar大鼠48只，雌雄各半，分籠飼養，體質量80～100 g，由山東大學實驗動物中心提供�；A飼料適應性喂養1周后，隨機分為對照組、A、B、C共4組，每組12只，分別給予含VC為0、2 000、5 000、10 000 mg/kg的飼料（在基礎飼料中添加VC并充分混勻，低溫壓制并經循環風自然干燥，飼料制成后立即放入-20 ℃冰箱中保存）。各組動物自由飲水，環境溫度維持在23～25 ℃。實驗期為8周�；A飼料的成分組成（%）：面粉20，玉米粉30，豆面15，麩皮25，魚粉5，骨粉1，食鹽1，酵母粉1，色拉油2，核黃素0.004，魚肝油0.04。
1.2 檢測指標及方法
1.2.1 血樣采集 大鼠處死前12 h撤掉食物，應用200 g/L的烏拉坦麻醉后經腹主動脈取血，留取800 μL紅細胞，按低滲一步溶血法[2]制備紅細胞膜備用，并同時分離淋巴細胞。其余全血離心獲取血漿置于-20 ℃冰箱中保存待測。
1.2.2 血漿VC測定 采用2，4?二硝基苯肼法。
1.2.3 血漿超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量以及紅細胞膜谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?Px）活性測定SOD活性測定采用羥胺法，GSH?Px活性測定采用DTNB直接法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸比色法。SOD、GSH?Px、MDA試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.2.4 紅細胞膜流動性測定 采用Lowry法測蛋白，調整膜蛋白的濃度為200～800 mg/L, DPH熒光標記紅細胞膜。應用美國PE公司LS?50型熒光分光光度計測熒光偏振度，Ex 362 nm，Em 432 nm，狹縫10 nm，溫度25 ℃，按文獻[4]公式計算熒光偏振度P值和微黏滯度η值。
1.2.5 外周血淋巴細胞增殖活性的測定 采用ELX 2800酶標儀(美國BioTek公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測定。
1.2.6 DNA氧化損傷分析 采用單細胞凝膠電泳或彗星電泳技術檢測[3]，取新鮮抗凝血30 μL，經分離獲取淋巴細胞，分別應用0、10、25 μmol/L的H2O2氧化處理5 min。將DAPI熒光染色的細胞核在熒光顯微鏡下觀察100個“彗星”細胞，根據拖尾的長度衡量DNA鏈斷裂損傷程度（AU）[4]。
1.3 統計學處理
采用SPSS 11.0和PPMS 1.5[5]統計軟件進行數據處理，數據間比較采用單因素方差分析。
2 結果
2.1 各組血漿VC、SOD、MDA含量和紅細胞膜GSH?Px活性比較
與對照組比較，A組血漿SOD活性升高（F=2.987,q=4.24，P<0.05），MDA含量顯著下降（F=4.176,q=4.23，P<0.05）；C組的血漿VC含量明顯升高（F=3.235,q=4.63，P<0.01），SOD活性明顯下降（q=4.13，P<0.05），MDA含量明顯升高（q=4.08，P<0.05），紅細胞膜GSH?Px 活性明顯下降（F=3.475,q=3.68，P<0.05）。與A組比較，B組和C組MDA含量明顯升高（q=4.73～5.20，P<0.01），SOD活性明顯下降（q=3.58～3.65，P<0.05）；C組的血漿VC含量明顯升高（q=4.51，P<0.01），紅細胞膜GSH?Px 活性明顯下降（q=3.84，P<0.05）。 見表1。
表1 各組血漿VC、SOD、MDA含量和紅細胞膜GSH?Px活性比較（略）
與對照組比較，F=2.987～4.176，*q=3.68～4.63，P<0.05；與A組比較，#q=3.58～5.20，P<0.05
2.2 各組大鼠淋巴細胞增殖活性的比較
對照組淋巴細胞增殖活性為0.042±0.036，A組為0.111±0.115，B組為0.049±0.059，C組為0.041±0.047。與對照組比較，A組的外周血淋巴細胞增殖活性明顯升高（F=2.278，q=3.67，P<0.05）；與A組比較，C組的淋巴細胞增殖活性明顯降低（q=4.19，P<0.05）。
2.3 各組大鼠紅細胞膜流動性的比較
與對照組比較，A組紅細胞膜P、η值顯著升高（F=2.458、2.763，q=3.84、4.23，P<0.05）；與A組比較，C組紅細胞膜P、η值顯著下降（q=4.61、6.54，P<0.01）。見表2。
2.4 各組大鼠淋巴細胞DNA氧化損傷的比較
與對照組比較，A、B、C各組大鼠0、5 μmol/L的H2O2誘發的DNA氧化損傷的差異均無顯著性（F=0.485、0.250，P>0.05）。B組和C組大鼠10 μmol/L的H2O2誘發的DNA氧化損傷增高,差異有顯著性（F=4.137，q=3.94、4.25，P<0.05）。
見表3。
表2 VC對紅細胞膜流動性的影響（略）
與對照組比較，F=2.458、2.763，*q=3.84、4.23；與A組比較，#q=4.61、6.54，P<0.01
表3 各組大鼠淋巴細胞DNA氧化損傷情況比較（略）
與對照組比較，F=4.137，*q=3.94、4.25，P<0.05
3 討論
VC為一種六碳糖酸的烯二醇內酯，易溶于水，為水溶性維生素，人體攝入生理量的VC之后，在消化道幾乎被全部吸收，其吸收的比例隨攝入VC量的增加而下降。一般認為，VC是水溶性的，不能在體內蓄積。本文結果顯示， 10 000 mg/kg劑量組血漿VC含量明顯高于對照組和2 000 mg/kg劑量組，提示攝入大劑量的VC超過了機體的代償能力，腎小管不能完全排除過量的VC，最終導致血漿VC水平上升。
但是，補充過高劑量VC(超過5 000 mg/kg)引起血漿SOD活性降低，MDA含量升高，紅細胞膜GSH?Px活性明顯下降，對紅細胞膜流動性、淋巴細胞的增殖活性沒有明顯的保護作用，甚至在H2O2誘導損傷時，反而造成淋巴細胞DNA損傷加重。SELMAN 等[6]研究顯示，長期大量補充VC對小鼠的壽命和氧化應激損傷沒有影響，反而會減少內源性抗氧化劑基因的表達。有研究指出，VC在一定條件下具有促氧化劑作用，健康人膳食中補充大劑量VC（500 mg/d）可產生促氧化劑活性，而給大鼠大劑量VC可顯著增高單氧酶活性，并使O-2的活性上升，繼而可能導致DNA損傷[7]。HININGER等[8]研究顯示，應用含大劑量VC（5 g）的EDTA螯合療法治療糖尿病或心血管疾病時，會產生明顯的促氧化效應，導致紅細胞SOD、GSH?Px等抗氧化酶活性下降。因此，當補充VC劑量過大時，引起血漿中VC的蓄積，VC可能發揮其促氧化作用，使自由基生成增加，激發了體內過氧化反應，體內活性氧濃度升高造成細胞氧化損傷，影響細胞功能，導致細胞增殖活性下降。
COOKE等[9]對健康人每天補充VC 500 mg，血中和尿中DNA氧化損傷產物8?OH?dG水平下降，VC水平升高，且二者之間呈較強的相關性。ANDERSON等[10]將人外周血淋巴細胞（含血清）與不同劑量的VC共同作用0.5 h，結果顯示，VC有促進DNA鏈斷裂的作用，且有劑量?反應關系。VC可破壞DNA的堿基和脫氧核糖，使DNA鏈降解。補充較大劑量的VC時，由于VC可能具有增加帶有著絲粒和非著絲粒微核形成的傾向，可作為前氧化物損傷著絲粒或紡錘絲蛋白或作為一種紡錘絲斷裂劑造成DNA損傷的微核率增加[11]，從而促進DNA的誘導損傷。提示補充大劑量VC 加重DNA損傷。
綜上所述，健康機體攝入適宜劑量的VC即可以滿足抗氧化損傷的需要，維持細胞功能活性的穩定。過量補充VC對健康機體紅細胞膜流動性和外周血淋巴細胞沒有保護作用，反而會使機體抗氧化損傷能力下降。其作用機制有待進一步闡明。
【參考文獻】
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