88Arg IL-2的克隆構建及原核表達
作者：孟林 劉明軍 王斌 錢冬萌
【關鍵詞】 白細胞介素2;基因突變;原核表達;蛋白質印跡法;MTT比色法
�。壅菽康� 構建88Arg IL-2的重組克隆，并在大腸桿菌中表達。方法 根據天然IL-2的基因序列設計含目的突變位點的引物，經PCR定點誘變技術獲得 88Arg IL-2的重組克隆，插入原核表達質粒pGEX4T-2中，經IPTG誘導在大腸桿菌DH5α中表達88Arg IL-2與GST的融合蛋白。結果所表達的蛋白相對分子質量約為 42 000 。Western blot檢測結果表明，該蛋白具有與親本IL-2相同的抗原性。MTT比色結果表明，88Arg IL-2可促使IL-2依賴細胞株CTLL-2生長，具有與親本IL-2相近的生物學活性。結論 成功構建了88Arg IL-2的重組克隆，在原核表達系統中高效表達出融合蛋白，并且具有生物學活性。
�。坳P鍵詞］ 白細胞介素2;基因突變;原核表達;蛋白質印跡法;MTT比色法
�。跘BSTRACT］ObjectiveTo construct clone of88Arg IL-2 and express it in Escherichia coli. MethodsSite-specific mu-tated primers were designed according to natural IL-2 DNA sequence.88Arg IL-2 gene was amplified using PCR. Then the88Arg IL-2 gene was inserted into expression vector pGEX4T-2 and induced by IPTG to express the protein in E. coli DH5α. ResultsThe molecular weight of fusion protein was 42 000. Western blotting test revealed that it had good specificity to anti-IL-2. The result of MTT assay indicated that88Arg IL-2 could stimulate the proliferation of CTLL-2 which was IL-2-dependent cell strain. Conclusion88Arg IL-2 has been cloned; the fusion protein is expressed in prokaryotic expression system with biologic activity.
［KEY WORDS］interleukin-2; gene mutation; prokaryotic expression; immunoblotting; MTT assay
白細胞介素2（IL-2）可誘導T細胞增殖分化，增強CTL的細胞毒性，促進NK細胞、LAK細胞增殖并增強其活性等［1～3］。臨床上已經開始使用基因重組IL-2（rIL-2）作為治療多種惡性腫瘤的藥物［3］。但IL-2對靶受體的選擇性不高，當與NK細胞表面的中度親和力受體結合時，會導致NK細胞的過度活化，產生過量腫瘤壞死因子（TNF），從而導致系統毒性。因此，利用IL-2基因定位誘變技術，獲得既保持其原有生物學活性又增強對靶細胞作用特異性的變構體就顯得尤為重要。本實驗利用PCR定點誘變技術，將編碼IL-2的第88位酸性氨基酸天冬酰胺（Asn）變構為堿性氨基酸精氨酸（Arg），并將其構建成穩定的原核表達克隆，在此基礎上對變構IL-2（88Arg IL-2）融合蛋白進行了抗原性和生物學活性測定，為進一步研究其受體結合特異性，并將其開發成為新型的抗腫瘤免疫藥物奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 材料與試劑IL-2克隆由本教研室構建。原核表達載體pGEX4T-2、菌株E.coli JM109和E.coli DH5α均由本教研室保存。pGEM-T Easy載體、PCR試劑、T4 DNA連接酶、PCR產物純化試劑盒均購自Pro-mega公司。rhIL-2購自晶美生物公司。Anti-hu-manIL-2（Monoclonal antibody）購自PeproTech EC Ltd。Goat Anti-mouse IgG （γ chain specific）購自Southern Biotech Associates， Inc。MTT為Pro-mega公司分裝，TRIZOL試劑為Invitrogene公司產品。
1.2 方法
1.2.188Arg IL-2基因克隆的構建及序列測定 用 于構建IL-2基因克隆的引物為上游引物（P3）:5′- ACAATGTACAGGATGCAACT-3′，下游引物（P4）: 5′-TAATTATCAAGTTAGTGTTGA-3′。設計含突變位點的反向互補引物P5、P6。P5:5′-GACT-TAATCAGCCGTATCAACGTAATA-3′，P6: 5′-TATTACGTTGATACGGCTGATTAA-GTC-3′。使用上述4條引物經PCR定點誘變技術得到變構基因片段P3/P6、P5/P4，兩純化片段部分互補，以此為模板， 以P3、P4為引物行PCR擴增獲得88Arg IL-2基因。PCR產物純化后與T-Easy Vector連接，重組質粒標記為T-Easy/IL-2（sa），轉化至E.coli JM109，選擇陽性克隆，送至上海生物工程技術有限公司進行序列測定。
1.2.2pGEX4T-2/88Arg IL-2重組表達克隆構建和鑒定 根據88Arg IL-2基因序列，設計合成2條引物，IL-2上游引物:5′-GTCAGAATTCCCGCAC-CTACTTCAAGTTCGACA-3′，IL-2下游引物:5′-CACTGTCGACTCAAGTTAGTGTTGAGATG-ATG-3′。其中在IL-2上游引物的5′端引入EcoR Ⅰ的酶切位點和4個保護堿基，IL-2下游引物的5′端引入終止密碼子、Sal Ⅰ的酶切位點和4個保護堿基。PCR產物應用Promega公司Wizard DNA Clean-up純化后用EcoR Ⅰ和SalⅠ進行雙酶切后回收，同時對表達載體pGEX4T-2也用上述酶進行雙酶切后回收，用T4 Ligase將兩者連接后，轉化至E.coli DH5α中構建pGEX4T-2/88Arg IL-2重組 表達 克隆，再對重組載體進行EcoR Ⅰ 和Sal Ⅰ 酶切鑒定。
1.2.388Arg IL-2融合蛋白的表達和純化 挑取含pGEX4T-2/88Arg IL-2重組質粒的E.coli DH5α接種于LB培養液中（含100 mg/L氨芐青霉素），在37 ℃下振蕩培養至 A600約為0.6。加誘導劑IPTG至終濃度1 mmol/L，37 ℃繼續培養4 h。收集菌液，將菌斑超聲裂解。離心分離上清和沉淀，分別在 120 g/L SDS-PAGE凝膠中電泳。將電泳后的凝膠用考馬斯亮藍染液染色，觀察表達情況。另按上述方法經超聲裂解細菌，收獲大量上清液，加入GST Fusion Protein Purification bead振蕩30 min濃縮純化，以得到純化的pGEX4T-2/88Arg IL-2蛋白。
1.2.488Arg IL-2融合蛋白的Western blot鑒定 將電泳后的含表達 蛋白和標準相對分子質量蛋白Marker的凝膠用電轉儀（BIO-RAD公司產品）轉至PVDF膜上。電轉結束后，切下Marker膜條，用麗春紅染液染色備用。余下的膜條，用IL-2單克隆抗體（一抗）和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（二抗）在轉移后的PVDF膜上行酶免疫固定檢測88Arg IL-2的抗原性。
1.2.5MT T比色法檢測88Arg IL-2生物學活性 用含體積 分數0.1胎牛血清的RPMI 1640液體調整CTLL-2細胞濃度為（3～5）×108 /L，96孔板中每孔加100 μL，將純化后的變構IL-2定量到5 g/L，然后以此為原液進行倍比稀釋，設7個稀釋度， 每個稀釋度做3個復孔，同時設陽性對照孔（每 100 μL中 加入10 U rhIL-2標準品）、空白對照（加入培養液），37 ℃ CO2 培養24～48 h，待空白對照孔細胞95%死亡時，加入MTT 20 μL（50 g/L），繼續培養 4 h后 ，每孔再加入二甲基亞砜（DMSO） 200 μL終 止反應，微量振蕩器振蕩10 min，在酶標儀上檢測 570 nm 波長處各孔吸光度（ A ）。
2 結果
2.188Arg IL-2基因PCR產物鑒定及序列測定88Arg IL-2的PCR產物為472 bp（圖1）。基因測序結果進一步證實，插入的基因序列完全正確，并保證了插入基因的正確閱讀。
2.2pGEX4T-2/88Arg IL-2重組表達載體的酶切鑒定 pGEX4T-2/88Arg IL-2重組質粒經PCR鑒定、EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切鑒定后獲得了大小相符的片段（圖1）。
2.3重組質粒pGEX4T-2/88Arg IL-2在E.coli DH5α中的表達和初步純化 將含pGEX4T-2/88Arg IL-2重組體的E.coli DH5α經IPTG誘導，并用超聲粉碎處理菌體后進行SDS-PAGE電泳，同時設空菌、空質粒對照。結果在相對分子質量為42 000位置有明顯的融合蛋白表達條帶，并確認表達的融合蛋白大部分以包涵體的形式存在于菌體中（見圖2）。經GST Fusion Protein Purification bead純化后的融合蛋白電泳條帶見圖3。
2.4 Western blot鑒定 Western blot檢測結果表明，在相對分子質量為 42 000處 ，未經純化的融合蛋白和純化的融合蛋白均有一特異的棕色條帶（圖4），證明 88Arg IL-2融合蛋白與市售IL-2單克隆抗體發生特異性反應， 說明純化的88Arg IL-2融合蛋白保持天然的抗原性。
圖1 88Arg IL-2基因PCR產物及pGEX4T-2/88Arg IL-2重組質粒的酶切鑒定（略）
M為DL 2 000 Marker;①為IL-2基因;②為P5/P4片段;③為P3/P6片段;④為88Arg IL-2基因克隆插入T-A載體后PCR鑒定結果;⑤為pGEX4T-2/88Arg IL-2重組表達載體EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定
圖2 SDS-PAGE電泳結果 （略）
�、贋镈H5α誘導前;②為pGEX4T-2-DH5α誘導前;③為重組質粒-DH5α誘導前;④為DH5α誘導后;⑤為pGEX4T-2-DH5α誘導后;⑥為重組質粒-DH5α誘導后
圖3 融合蛋白純化的結果 （略）
M為蛋白Marker;①為重組質粒-DH5α誘導前;②為重組質粒-DH5α誘導后;③為純化的融合蛋白
圖4 Western blot鑒定結果 （略）
M為蛋白Marker;①為誘導細菌總蛋白的印跡;②為純化融合蛋白印跡
表1 不同稀釋度88Arg IL-2的吸光度（略）
3 討論
IL-2是20世紀90年代獲準上市的重組基因工程藥物。在自然狀態下，IL-2具有免疫活性，可以刺激機體的CTL細胞和NK細胞產生干擾素，這種 內源性的干擾素可以使單核-巨噬細胞發生活化，產生TNF-α，導致腫瘤細胞的程序性死亡。IL-2對于其靶受體的選擇性不高，在與中度親和力受體結合后，會導致NK細胞的過度活化，從而產生過量TNF-α，殺傷正常細胞。近年來，國內外將研究熱點放在對IL-2進行基因變構上，以期獲得高活性和高特異性的突變IL-2替代品。JU等［4］通過定位誘變得到50多種不同的突變體，分析它們的活性后證實在IL-2分子中有3段序列對維持其活性是必需的:①N端第1～20位氨基酸;②C端第123～133位氨基酸;③58位和105位Cys。N端、C端及中央的30～60位氨基酸組成了IL-2與其受體的結合部位，這些部位的氨基酸突變均可影響其受體的識別。ARAKAWA等［5］將IL-2分子中第125位的Cys突變成Ala或Ser，轉化至大腸桿菌后產生的IL-2具有與天然IL-2分子相同或更高的活性，而且生產方便。目前國外125Ser-IL-2已經FDA批準生產，125Ala-IL-2也已批準臨床試用。但這些點突變未能明顯改善與受體特異性結合的問題。ARMEN等［6］研究發現，在基因水平對IL-2進行特定位點的定位誘變，將編碼幾個特定位點的酸性氨基酸變為堿性氨基酸，可以顯著改變與IL-2受體α、β、γ鏈結合的親和力，從而增強變構IL-2與機體抗腫瘤免疫的主要細胞―― ―CTL細胞的活化，而減弱非特異性的NK細胞殺傷作用。本實驗室構建了變構IL-2（88Arg IL-2）的基因克隆，并在原核表達系統中高效表達了該蛋白的融合蛋白且獲得了純化的融合蛋白。該88Arg IL-2與目前市售IL-2單克隆抗體可發生特異性抗原抗體反應，提示該點突變對IL-2的抗原性沒有影響。在此基礎上，利用MTT比色法檢測了 88Arg IL-2促進IL-2依賴CTLL-2細胞株生長的作用，結果顯示，88Arg IL-2與天然IL-2有相近的生物學活性。但在本研究中，未能獲得HPLC純的非融合88Arg IL-2，暫時不便比較 88Arg IL-2與天然IL-2的活性高低。這將在今后的研究工作中進一步補充完善，并將探索比較其在激活CTL細胞、NK細胞、LAK細胞等方面的作用優勢。
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