大腸桿菌表達(dá)人IL?21融合蛋白的純化和抗原性分析
作者：付強(qiáng) 錢冬萌 閆志勇 侯偉 王斌
【摘要】 目的 在大腸桿菌中表達(dá)人IL?21編碼基因，并進(jìn)行蛋白純化和抗原性分析。方法 以經(jīng)PHA刺激的人扁桃體細(xì)胞cDNA 文庫為模板，經(jīng)PCR獲得IL?21全基因片段。測(cè)序確認(rèn)后，分別設(shè)計(jì)含BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)的引物，經(jīng)PCR獲得IL?21成熟肽的編碼基因。將此IL?21基因插入表達(dá)載體pGEX?4T?2，重組克隆經(jīng)酶切與測(cè)序確認(rèn)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)瓊脂糖珠結(jié)合的純化方法所得產(chǎn)物用Western Blotting作抗原性分析。結(jié)果 SDS?PAGE顯示經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的大腸桿菌DH5α表達(dá)與理論相符的條帶，并獲得了與理論值相符的純化條帶，在進(jìn)一步的Western Blotting分析中發(fā)現(xiàn)表達(dá)的蛋白能與IL?2的單抗產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)。結(jié)論 人IL?21編碼基因克隆載體在大腸桿菌中成功表達(dá)，同時(shí)建立了該蛋白的瓊脂糖珠純化方法，通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)揭示了原核表達(dá)的IL?21蛋白與IL?2之間結(jié)構(gòu)的相似性。
【關(guān)鍵詞】 白細(xì)胞介素21; 基因表達(dá);免疫印跡法；重組融合蛋白質(zhì)類
�。跘BSTRACT］ObjectiveTo express coding gene of human interleukin?21 (IL?21) in E.coli, purify its protein, and assay its antigenicity.MethodsHuman IL?21 gene fragments were obtained from human tonsil cDNA by PCR. The coding gene for the mature N terminus of IL?21 was inserted into prokaryotic expressing vector pGEX?4T?2 and transformed into E.coli DH5α. The expressed product was purified by affinity chromatography using GST Fusion Protein Purification bead and its antigenicity analyzed by Western Blotting.ResultsInduced by IPTG, E.coli DH5α expressed the right molecular weight protein. Western Blotting test showed the protein had reaction with IL?2 monoclonal antibody.ConclusionThe vector pGEX?4T?2/IL?21 and engineering bacteria E.coli DH5α expressing IL?21 mature N terminus fusion protein is successfully constructed. By purification and Western Blotting test, the recombinant IL?21 revealed resemblant antigenicity to IL?2.
［KEY WORDS］Interleukin?21; Gene expression; Immunoblotting; Recombinant fusion proteins
以美國JULIA教授為首的研究小組在國際上首次構(gòu)建了BaF3/IL?21R細(xì)胞系，并用此細(xì)胞系從活化的CD+3細(xì)胞中分離并鑒定了一類新的細(xì)胞因子——人白細(xì)胞介素21（IL?21）[1]，此后世界范圍多個(gè)實(shí)驗(yàn)室相繼進(jìn)行了相關(guān)研究。現(xiàn)在已知IL?21具有廣泛的生物學(xué)功能，能夠調(diào)節(jié)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，刺激T、B和NK細(xì)胞的增殖、活化和分化，并且對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用[2～4]。本研究構(gòu)建了中國人IL?21基因編碼的重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)[5]。同時(shí)通過進(jìn)一步對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行GST親和層析純化后，使用IL?2單克隆抗體與重組蛋白做Western Blotting抗原性分析。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。
1 材料和方法
1.1 質(zhì)粒、菌株和主要試劑
質(zhì)粒pGEX4T?2和菌株E.coli JM109、E.coli DH5α均為本室保存。PCR試劑、T4 DNA連接酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、pGEM?T Easy Vector 試劑盒均購自Promega公司。DNA限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Sal Ⅰ 均購自Takara公司。引物均由北京賽百盛公司合成(PAGE純化)，GST Fusion Protein Purification bead 購自Amersham公司。
1.2 IL?21全編碼基因的克隆
將經(jīng)PHA刺激培養(yǎng)48 h的人扁桃體細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用T4 DNA連接酶將7.5 μL PCR純化產(chǎn)物與0.5 μL T?Easy載體連接。同時(shí)，使用TSS法制備感受態(tài)大腸桿菌JM109，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后在涂有X?Gal和IPTG的ALB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),37 ℃放置12～16 h。 通過藍(lán)白斑法選擇陰性、陽性克隆，從中提取重組質(zhì)粒DNA，采用 PCR和酶切初步鑒定后，進(jìn)行DNA序列測(cè)定分析。
1.3 IL?21重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
利用含BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)的引物，經(jīng)PCR獲得IL?21成熟肽的編碼基因。經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物及載體pGEX4T?2同時(shí)用核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ消化后以T4連接酶連接，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒。對(duì)用TSS法新鮮制備的感受態(tài)E.Coli.DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化。對(duì)轉(zhuǎn)化長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行質(zhì)粒小提，用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行初步鑒定后，進(jìn)行DNA序列測(cè)定分析。
1.4 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
挑取單個(gè)重組成功菌落接種于5 mL Amp?LB中, 37 ℃震蕩培養(yǎng),當(dāng)菌液吸光度達(dá)到0.4～0.6時(shí),用終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)目的基因在大腸桿菌DH5菌中的表達(dá)。分別于誘導(dǎo)后1、2、4 h取菌液3 mL，12 000 r/min離心1 min，沉淀用SDS凝膠加樣緩沖液震蕩后置沸水浴5 min，稍微離心，上清移至新管,-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆�。同時(shí)，用DH5α宿主菌和未誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒的DH5α菌，以及誘導(dǎo)的含pGEX4T?2質(zhì)粒的DH5α菌樣品作對(duì)照行SDS?PAGE。
1.5 表達(dá)蛋白的純化和Western Blotting分析
根據(jù)37 ℃時(shí)蛋白表達(dá)情況，降低細(xì)菌的誘導(dǎo)溫度到23 ℃進(jìn)行大體積低溫誘導(dǎo)3 h。收集菌液，經(jīng)離心后，將菌斑用適當(dāng)體積的PBS液洗滌兩次后再次重懸，冰浴下超聲裂解細(xì)菌。4 ℃，14 000 r/min離心10 min分離上清。將上清中加入GST Fusion Protein Purification bead震蕩30 min純化濃縮上清中的蛋白。將誘導(dǎo)的菌體、純化的融合蛋白進(jìn)行SDS?PAGE電泳，電泳后用Bio?Rad公司的電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。電轉(zhuǎn)結(jié)束后將膜在麗春紅染液中染色，用鉛筆標(biāo)記出蛋白Marker。然后，參照分子克隆實(shí)驗(yàn)操作。一抗為IL?2的單克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG。
2 結(jié) 果
2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增的IL?21全編碼基因長(zhǎng)為642 bp，其中成熟N端編碼基因長(zhǎng)為396 bp。同DNA標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量參照物相比，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小與預(yù)測(cè)的結(jié)果一致（圖1）。
2.2 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
經(jīng)PCR擴(kuò)增出的IL?21成熟肽的編碼基因片段和鑒定重組成功的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后同時(shí)進(jìn)行電泳，可見酶切產(chǎn)物和PCR擴(kuò)增條帶大小與理論
值相符（圖2）。
2.3 表達(dá)蛋白的SDS?PAGE
經(jīng)SDS?PAGE，考馬斯亮藍(lán)R?250染色觀察，含重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)菌在相對(duì)分子質(zhì)量為41 000位置出現(xiàn)一蛋白條帶，而未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在相應(yīng)位置沒有蛋白條帶；含質(zhì)粒pGEX4T?2的誘導(dǎo)菌在相對(duì)分子質(zhì)量為26 000位置出現(xiàn)一條帶。目的基因表達(dá)的多肽相對(duì)分子質(zhì)量估計(jì)為15 000，與融合蛋白共同表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量約為41 000的多肽，與理論估計(jì)相一致。經(jīng)凝膠成像掃描，融合蛋白產(chǎn)量占總蛋白的10%（圖3）。
2.4 表達(dá)蛋白的純化
大體積蛋白表達(dá)后，將細(xì)菌裂解液上清和純化濃縮的蛋白進(jìn)行電泳分析，結(jié)果顯示得到理想的純化融合蛋白條帶(圖4)。
將純化的融合蛋白進(jìn)行SDS?PAGE，電泳后作Western Blotting分析，結(jié)果可見有與理論相符的條帶（圖 5）。
3 討 論
人IL?21是IL?2家族中的新成員，主要由活化的CD+4 T細(xì)胞產(chǎn)生，與IL?2、IL?15、IL?4等細(xì)胞因子具有高度同源性。其基因定位于4q26?27, 距離IL?2 基因約180 kb。結(jié)構(gòu)分析表明，成熟的人IL?21 含有四螺旋族細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域與IL?2、IL?4、IL?15 的四螺旋族細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域有較高的同源性。IL?21 與IL?15 在相同的位置有兩對(duì)相同的半胱氨酸, 其中一對(duì)在IL?2、IL?4中具有保守性。最近通過核磁共振技術(shù)獲得的高精三維結(jié)構(gòu)表明，人IL?21有不同的同工異構(gòu)體，并在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)十分不同的活性[6]。
本實(shí)驗(yàn)從活化扁桃體細(xì)胞中克隆出人IL?21的cDNA并進(jìn)行序列測(cè)定，同時(shí)構(gòu)建了中國人IL?21表達(dá)克隆，并在DH5α宿主菌中表達(dá)出與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合的蛋白。采用瓊脂糖珠結(jié)合的純化方法，獲得了與理論值相符合的純化條帶。在進(jìn)一步的Western Blotting分析中顯示，該種條件下表達(dá)的融合蛋白能與IL?2的單抗產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合人IL?21最新的結(jié)構(gòu)分析和體外活性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了人IL?21在臨床與IL?2聯(lián)用或單獨(dú)使用具有的調(diào)節(jié)免疫功能和抗腫瘤活性[2,7]，并為進(jìn)一步檢測(cè)人IL?21的各種體內(nèi)外活性奠定了理論和實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。
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