人突變CD59的表達、純化及抗原性鑒定
【摘要】 目的 獲得純化人突變CD59(hmCD59)蛋白，制備其特異性抗體，對純化產物進行鑒定。方法 將含有hmCD59全長序列的重組pALTER質粒,運用脂質體介導法轉染CHO細胞,采用SDS?PAGE檢測hmCD59的表達情況，表達產物經ANTI?FLAG M2 Affinity Gel純化后制備抗血清，以此抗血清鑒定純化產物。結果 hmCD59在CHO細胞獲得表達，ANTI?FLAG M2 Affinity Gel純化后可獲得電泳純的hmCD59蛋白，hmCD59與小鼠抗hmCD59抗血清具有特異性反應。結論 從真核細胞獲得了電泳純并具有抗原性的hmCD59蛋白，為進一步對其進行抗體制備、功能研究及臨床應用奠定了基礎。
【關鍵詞】 人突變CD59 真核細胞表達 純化 抗原性
［ABSTRACT］ObjectiveTo obtain purified human mutant CD59 (hmCD59) protein and to identify the purified product with specific antiserum against hmCD59 protein.MethodsThe recombinant pALTER plasmid containing hmCD59 cDNA was transfected into CHO cells with pcDNA3 by lipofectamine. Expression of hmCD59 on CHO cells was detected by SDS?PAGE. The recombinant protein was purified by ANTI?FLAG M2 Affinity Gel. The antiserum was prepared with the purified hmCD59 and used to identify the purified hmCD59.ResultshmCD59 protein was purified by ANTI?FLAG M2 Affinity Gel. Furthermore, hmCD59 had specific reactivity with mouse anti?hmCD59 antiserum.ConclusionThe purified hmCD59 protein has been obtained successfully, which lays the foundation for preparing antibody, further functional study and clinical application of hmCD59.
［KEY WORDS］human mutant CD59; eukaryotic cells expression; purification； antigenicity
CD59是一種廣泛分布于組織細胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨固膜蛋白,相對分子質量較小,只有 20 000左右,在補體活化通路的不同階段限制補體活化，成為攻膜復合體（MAC）形成的關鍵抑制物,從而保護自身正常的組織細胞免受補體損傷［1］。國內外研究顯示，人CD59糖化后失去抑制MAC的功能［2］，突變人CD59(hmCD59)在高糖環境下更加易于糖化失活，抗補體活性更快降低［3］ ，MAC沉積增加，內皮釋放生長因子，引發糖尿病病人血管增殖［4］。人類糖尿病血管并發癥發生的潛在機制仍然不十分清楚，尤其是hmCD59與糖尿病并發癥的相關性鮮有報道。本研究報道hmCD59蛋白的表達、提取、純化及抗原性鑒定，為下一步制備抗hmCD59單克隆抗體并對其進行臨床應用研究奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 質粒、菌株與細胞株 質粒hmCD59?PALTER由本室構建保存。pcDNA3由美國哈佛大學提供。CHO細胞株由本室保存。
1.1.2 主要試劑 EcoRⅠ購自寶生物大連有限公司。RPMI 1640培養基購自HyClone公司。小牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產品。G418選擇性抗生素購自于Amresco公司。LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產品。ANTI?FLAG M2 Affinity Gel Freezer?Safe為Sigma?Aldrich公司產品。Vivaspin 2超濾濃縮離心管為Sartorius公司產品。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均為Sigma公司產品。HRP標記的羊抗小鼠IgG為北京中山生物技術有限公司產品。其他試劑均為國產或進口分析純。
1.2 實驗方法
1.2.1 質粒hmCD59?PALTER的鑒定 將hmCD59?PALTER質粒經EcoRⅠ酶切鑒定并經上海生物工程公司測序確認。
1.2.2 hmCD59在CHO細胞中的表達 重組質粒hmCD59?PALTER對CHO細胞的轉染,參照LipofectamineTM 2000的說明書進行。轉染后24 h將細胞作1∶10稀釋后傳代,48 h后加入選擇培養液(含有800 mg/L的G418)篩選陽性克隆2周，挑取單個克隆,繼續抗性篩選2周,其陽性克隆的后續培養始終在G418維持劑量(400 mg/L)下進行。收集生長狀態良好的陽性CHO細胞，裂解后離心取上清以SDS?聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）鑒定蛋白的表達。
1.2.3 目的蛋白hmCD59的純化 獲取生長良好的107～108個轉染CHO細胞 ，加入細胞裂解液(含50 mmol/L Tris HCl,pH 7.4, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA,體積分數0.01的TRITONX?100)10 mL,冰上振蕩裂解30 min后低溫離心取上清待用。將ANTI?FLAG M2 Affinity Gel裝柱并靜置，待填料完全沉降后，用TBS （其中含50 mmol/L Tris HCl,150 mmol/L NaCl, pH 7.4)沖洗，連續加3次柱體積的0.1 mol/L甘氨酸HCl (pH 3.5)洗膠，再以TBS在4 ℃平衡樹脂。加入總蛋白提取物，在重力作用下多次流經親和柱，保持 4 ℃，控制流量為1 mL/min,再用10～20個柱容積的TBS沖洗，去掉未結合的雜蛋白，經磺硫酸檢測無蛋白流出。然后用6個1 mL的0.1 mol/L甘氨酸HCl (pH 3.5)進行洗脫，分別收集入6個含有20 μL 1.0 mol/L Tris (pH 8.0)的管中。
1.2.4 hmCD59的SDS?PAGE鑒定 SDS?PAGE中使用120 g/L的分離膠和50 g/L的濃縮膠。將收集的洗脫峰蛋白2 mL裝入Vivaspin 2超濾濃縮離心管中，3 000 r/min離心12 min進行濃縮至濃度為1 g/L。取20 μL濃縮后樣品與等體積2×上樣緩沖液混勻后，在沸水浴中加熱5 min,上樣，起始電壓為70 V。當樣品移出濃縮膠與分離膠的分界處時，加大電壓到100 V至電泳終了，經考馬斯亮藍染色后觀察結果。
1.2.5 小鼠抗hmCD59抗血清的制備 將hmCD59與等體積弗氏完全佐劑制成乳化劑，以10 μg劑量多點注射于2只6～8周齡雌性BALB/C小鼠的背部，21 d后以同樣劑量的hmCD59與弗氏不完全佐劑乳化進行第一次加強免疫，背部皮下多點注射，14 d后以同樣方法進行第2次加強免疫。10 d后斷尾采血制備抗血清。將hmCD59蛋白進行稀釋（2、10 mg/L）后包被，均設3個復孔。以酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定抗血清的效價，免疫前小鼠血清作為陰性對照。
2 結 果
2.1 質粒hmCD59?PALTER的鑒定
以EcoRⅠ對hmCD59?PALTER進行酶切，獲得1條496 bp的電泳帶,與插入的目的基因片段大小相一致（圖1）。測序結果表明, hmCD59?PALTER59含有突變的CD59全長cDNA序列。
2.2 目的蛋白hmCD59的表達
已轉染hmCD59?PALTER的CHO細胞SDS?PAGE分析顯示，在相對分子質量為20 000處出現條帶（圖2），同預期結果一致。
2.3 目的蛋白hmCD59的純化
將轉染CHO細胞總蛋白提取物經過ANTI?FLAG M2 Affinity Gel親和層析純化，收集洗脫液，濃縮后經SDS?PAGE并用考馬斯亮藍染色顯示，得到電泳純hmCD59蛋白（圖3）。
2.4 抗hmCD59抗血清的制備及鑒定
以純化的hmCD59為免疫原，免疫2只BALB/C小鼠，在2次加強免疫后取血制備抗血清，2只小鼠的抗血清效價均在1∶10 000以上，免疫前血清與hmCD59無特異性反應，表明獲得了抗hmCD59的抗血清。
3 討 論
糖尿病血管增殖癥是嚴重危害糖尿病病人的并發癥，明確糖尿病血管增殖癥的發病機制并有效防治，是目前糖尿病診斷及治療領域中的重點。研究證實，CD59作為一種補體調節蛋白，可阻止MAC形成，對于保護自身細胞免受補體損傷起到了關鍵的作用［ 5,6］。對CD59結構及功能的研究揭示，人類CD59分子存在易于糖基化位點K41?H44［7］，糖化人CD59失去了MAC的抑制功能［2］。近年來，有研究表明，人CD59糖基化位點突變后在高糖環境下更加易于糖基化而失去抗補體活性［3］，致使MAC大量沉積于血管內皮，促使血管內皮釋放成纖維細胞生長因子、血小板源性生長因子，刺激成纖維細胞、平滑肌細胞過度增殖，從而發生血管增殖癥及硬化癥［4］。因此,有學者推測糖尿病病人體內存在CD59基因突變，但目前國內外尚無能夠用于檢測抗hmCD59的抗體，hmCD59的提取、純化及鑒定國內外也尚未見報道。
【參考文獻】
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