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Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)乳化異氟醚預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)
【摘要】 目的 探討乳化異氟醚預(yù)處理對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并且證明這1作用由Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)。方法 將SD大鼠制成肝臟缺血再灌注模型，隨機(jī)分為脂肪乳劑對照組(C) 、Kupffer細(xì)胞阻斷對照組(CK) 、乳化異氟醚預(yù)處理組(IPC)和Kupffer細(xì)胞阻斷后乳化異氟醚預(yù)處理組(IK)，觀察肝臟缺血60min 再灌注2h 后血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT) 、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肝細(xì)胞勻漿丙2醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和肝組織病理學(xué)改變。結(jié)果 C組、CK組和IK組肝臟缺血再灌注后血清ALT 和AST 含量顯著升高，肝細(xì)胞勻漿MDA含量增高，SOD含量降低，肝組織病理學(xué)損害明顯增加；而IPC組肝臟缺血再灌注后血清ALT 和AST 含量與前3組相比顯著降低，肝細(xì)胞勻漿MDA含量減少，SOD含量增加，肝組織病理學(xué)損害明顯減輕。結(jié)論 乳化異氟醚預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，并且這1作用由Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)。
【關(guān)鍵詞】 Kupffer細(xì)胞；乳化異氟醚；缺血再灌注損傷
Kepffer cells mediated emulsified isoflurane precondition against hepatic ischemia and reperfusion injury in the rats
LV Hao，YANG Li-qun，YU Wei-feng，REN Hong-mei，ZHU Min，XU Li-ya.Department of Anesthesiology，Eastern Hepatobiliary Surgical Hospital，the Second Military Medical University，Shanghai 200438，China.
Corresponding author:YU Wei-feng
【Abstract】 Objective To investigate the protective effect of pretreatment with emulsified isoflurane on liver ischemia and reperfusion injury in rats. Methods A total of 32 healthy adult SD rats,weighing between 250 g to 300 g,were randomly divided into four groups: preconditioning with intralipid group (C , n = 8),inhibition of Kupffer cell and preconditioning with intralipid group (CK,n = 8), preconditioning with emulsified isoflurane group (IPC,n = 8), inhibition of Kupffer cell and preconditioning with emulsified isoflurane group (IK,n = 8). Rats suffered from ischemia for 30 min and were followed by reperfusion for 2 hours. The amimals were killed at 2 hours after reperfusion. Serum levels of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were determined.Hepatic cell homogenate levels of MDA and SOD were determined. The histopathologic changes in the liver were also observed. Results Compared with those in C ,CK and IK groups,in IPC group serum levels of ALT and AST decreased significantly after liver ischemia and reperfusion. Hepatic cell homogenate levels of MDA decreased and SOD increased. The injury degrees of liver histopathology in IPC group was much less than that in C,CKand IK groups. Conclusion Pretreatment with emulsified isoflurane can protect liver from ischemia and reperfusion injury and this effect may mediated by Kupffer cells.
【Key words】 Kupffer cells; emulsified isoflurane; ischemia and reperfusion injury
最近的研究顯示異氟醚等吸入麻醉的藥預(yù)處理對大鼠心、腦、腎、肺、脊髓早期的缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，并且揭示了部分的作用機(jī)制[1-5] 。吸入麻醉的藥對肝臟的影響,過去研究大多集中在對肝臟的毒性作用,然而,吸入麻醉的藥可誘發(fā)肝臟的保護(hù)作用。在大鼠缺血再灌注及培養(yǎng)肝細(xì)胞缺氧復(fù)氧損害模型中,異氟醚、7氟醚和氟烷能減輕早期缺血再灌注或缺氧復(fù)氧損害[6-7]。異氟醚預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用目前國內(nèi)外的研究不多，其機(jī)制的研究還處于起步階段。本實驗擬采用大鼠肝臟缺血再灌注模型,研究異氟醚預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，以期為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1. 1 研究對象
SD大鼠32只，雄性，質(zhì)量250～300 g，由第2軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。將動物分為4組：脂肪乳劑對照組(C組, n =8)，經(jīng)大鼠尾靜脈用微量泵給予脂肪乳劑預(yù)處理，劑量為30%脂肪乳劑(華瑞制藥有限公司提供)6ml/kg/h，持續(xù)給藥半小時，停藥15分鐘，然后進(jìn)行缺血再灌注；Kupffer細(xì)胞阻斷對照組(CK組, n =8) ,實驗前24h大鼠腹腔注射Kupffer細(xì)胞特異性阻斷劑氯化釓（10mg/kg），其余同C組；乳化異氟醚預(yù)處理組(IPC組, n =8)，經(jīng)大鼠尾靜脈用微量泵給予乳化異氟醚預(yù)處理，劑量為8%乳化異氟醚6ml/kg/h，持續(xù)給藥半小時，停藥15分鐘，然后進(jìn)行缺血再灌注；Kupffer細(xì)胞阻斷后乳化異氟醚預(yù)處理組(IK組, n =8) , 實驗前24h大鼠腹腔注射Kupffer細(xì)胞特異性阻斷劑氯化釓（10mg/kg），其余同IPC組。
1. 2 乳化異氟醚配制
8% 乳化異氟醚的制備是在無菌條件下于20 ml 消毒安瓿中分別加入30 % 脂肪乳18.4 ml 和液態(tài)異氟醚1.6 ml，用酒精噴燈封接安瓿，于混旋振蕩器上振蕩15 min，使液態(tài)異氟醚充分乳化[8]。
1. 3 肝臟缺血再灌注模型的制作
大鼠術(shù)前12h禁食，自由飲水，腹腔注射3% 戊巴比妥鈉(30 mg/ kg) 麻醉,上腹正中切口進(jìn)腹,分離肝臟周圍韌帶,暴露肝門, 游離肝門部血管，用小號動脈夾阻斷門靜脈左、中分支( 約占全肝70%) ,完全夾閉門靜脈和肝動脈,完全阻斷左、中肝臟血流,造成左、中肝葉完全缺血,保留右肝(約占全肝30 %) 血供,作為門靜脈血液回流通道，以防腸道淤血。同時大鼠尾靜脈穿刺置入24G套管針，后接微量泵進(jìn)行預(yù)處理給藥。微量泵持續(xù)給藥30min，停止15min，然后肝門部分阻斷（左、中）30min，后去除肝門阻斷夾,恢復(fù)肝臟灌流，再灌注2h后取標(biāo)本。
1. 4 標(biāo)本采集及檢測方法
所有動物于實驗結(jié)束收集下腔靜脈血4 ml，離心析出血清，以日本產(chǎn)Olympus AU 2700 型全自動生化分析儀，測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT) 、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST) 含量。取新鮮肝左葉組織制成10%肝組織勻漿，用考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒（南京建成生物制劑有限公司）測定肝組織蛋白含量，并用MDA和SOD試劑盒（南京建成生物制劑有限公司）測定肝組織勻漿MDA和SOD含量。同時取肝左葉組織置10 % 甲醛液中固定，常規(guī)切片和HE 染色，光鏡下觀察肝組織病變情況。選取損傷最為明顯的再灌注24 h 的病理切片，光鏡下評定肝組織損傷分級，其分級標(biāo)準(zhǔn):0級:肝小葉、肝細(xì)胞、肝細(xì)胞索、中央靜脈、肝竇均正常；Ⅰ級:個別肝細(xì)胞變性，匯管區(qū)少量炎細(xì)胞聚集；Ⅱ級:肝中央靜脈、肝竇內(nèi)瘀血及散在肝細(xì)胞變性壞死，肝組織內(nèi)炎細(xì)胞聚集較多，肝小葉結(jié)構(gòu)完整；Ⅲ級:肝中央靜脈、肝竇內(nèi)瘀血及廣泛肝細(xì)胞變性壞死，大量炎細(xì)胞聚集，部分肝組織結(jié)構(gòu)破壞不完整。
1. 5 統(tǒng)計學(xué)處理
采用SPSS11.0 統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)以x±s 表示，多組均數(shù)比較的方差分析檢測各組間的差異，肝組織損傷分析用秩和檢驗。
2 結(jié)果
2. 1 血清酶學(xué)變化結(jié)果見表1
脂肪乳劑對照組、Kupffer細(xì)胞阻斷對照組和Kupffer細(xì)胞阻斷后乳化異氟醚預(yù)處理組缺血再灌注后血清ALT 、AST水平均顯著升高，3組間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異。乳化異氟醚預(yù)處理組缺血再灌注后血清ALT 、AST水平與前3組相比均明顯降低，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義( P<0.05) 。
2. 2 肝細(xì)胞勻漿MDA和SOD變化見表1
脂肪乳劑對照組、Kupffer細(xì)胞阻斷對照組和Kupffer細(xì)胞阻斷后乳化異氟醚預(yù)處理組缺血再灌注后肝細(xì)胞勻漿MDA水平均顯著升高，SOD水平均顯著降低，3組間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異。乳化異氟醚預(yù)處理組缺血再灌注后肝細(xì)胞勻漿MDA水平與前3組相比均明顯降低，SOD水平與前3組相比均明顯升高，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義( P<0.05) 。
表1 各組再灌注2h后ALT 、AST、MDA、SOD含量(x±s，n = 8)
組別 ALT（IU/L） AST（IU/L） MDA（nmol/mg） SOD（NU/mg）
C組 548.79±350.31+ 1247.39±678.81+ 4.95±0.74+ 69.16±7.11+
CK組 530.91±297.25▲ 747.45±420.18▲ 5.02±0.64▲ 71.86±2.99▲
IK組730.55±542.81★ 1786.95±1124.23★ 5.22±0.90★ 72.03±6.89★
IPC組205.06±79.88 483.28±151.89 3.54±0.66 87.77±5.52
與IPC組比較，+P<0.05，▲P <0.05，★P <0.05 上1頁12 下1頁
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2. 3 肝組織病理學(xué)改變
C組肝臟再灌注后2 h，肝中央靜脈、肝竇內(nèi)瘀血，廣泛肝細(xì)胞變性壞死，匯管區(qū)大量炎細(xì)胞聚集，部分肝組織結(jié)構(gòu)破壞不完整，見圖1；CK組再灌注后2 h，主要以肝細(xì)胞局灶性及片狀壞死為主，匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤，中性粒細(xì)胞為主， 部分肝竇擴(kuò)張、淤血，肝細(xì)胞可見不同程度的水腫變性和空泡狀變性，偶爾可見點狀壞死，見圖2；IK組肝臟再灌注2 h，肝中央靜脈、肝竇內(nèi)瘀血，部分肝細(xì)胞變性壞死，肝組織內(nèi)炎細(xì)胞聚集較多，見圖3；IPC組再灌注后2 h，部分肝細(xì)胞氣球樣變，偶爾可觀察到灶性壞死，未見成片狀細(xì)胞壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見組織結(jié)構(gòu)破壞，見圖4。
再灌注2 h 病理切片肝組織損傷分級，屬于Ⅱ～Ⅲ級范疇的動物數(shù)：C組8例，CK組7例，IK組8例，IPC組只有1例，其余CK組1例，IPC組7例屬于0～Ⅰ級。C組、CK組和IK組比較肝組織損傷程度無統(tǒng)計學(xué)差異，而IPC組與前3組相比肝組織損傷程度顯著降低，其差異均有統(tǒng)計學(xué)差異( P<0.05)。
圖1 C組再灌注后肝臟組織變化 (HE ×200)
圖2 CK組再灌注后肝臟組織變化 (HE ×200)
圖3 IK組再灌注后肝臟組織變化 (HE ×200)
圖4 IPC組再灌注后肝臟組織變化 (HE ×200)
3 討論
目前的研究表明以異氟醚為
代表的吸入麻醉的藥預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其可能的機(jī)制有：（1）減少細(xì)胞外氧應(yīng)激產(chǎn)生O2-。來源于肝臟Kupffer細(xì)胞的細(xì)胞外氧應(yīng)激是導(dǎo)致再灌注初期血管和肝細(xì)胞損傷的主因。異氟醚可抑制肝臟復(fù)氧后O2-產(chǎn)生，通過減少細(xì)胞外氧應(yīng)激保護(hù)了肝細(xì)胞活性[9]。（2）對肝細(xì)胞的能量保護(hù)作用。能量供應(yīng)是肝細(xì)胞維持1切活動的基礎(chǔ)，異氟醚對不可逆缺氧和復(fù)氧的能量失衡都有重要的保護(hù)作用[10]。（3）減輕細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載等。
本研究中乳化異氟醚預(yù)處理組與脂肪乳劑對照組相比肝臟缺血再灌注后血清ALT、AST以及肝組織中MDA水平明顯減輕，肝組織中SOD水平明顯增加，并且肝組織病理損害也明顯減輕，說明乳化異氟醚預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。用特異的Kupffer細(xì)胞阻斷劑氯化釓阻斷后再用乳化異氟醚進(jìn)行預(yù)處理，肝臟缺血再灌注后血清ALT、AST，肝組織中MDA、SOD水平以及肝組織病理損害與脂肪乳劑對照組相比無顯著差異，證明了乳化異氟醚預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用由Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)。
Kupffer 細(xì)胞是位于肝血竇腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞,它寄居于肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞之上或之間,并通過突入內(nèi)皮細(xì)胞下Disse 間隙的胞漿突起與肝細(xì)胞直接接觸。Kupffer 細(xì)胞作為與從胃腸道內(nèi)吸收的微粒和免疫活性物質(zhì)接觸的第1 道防線,具有胞吞、胞飲,抗原提呈和分泌生物活性物質(zhì)3 大功能。肝臟缺血再灌注后Kupffer細(xì)胞被門靜脈血中的內(nèi)毒素（LPS）激活，激活的Kupffer 細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)并產(chǎn)生反應(yīng)性氧元素(ROS)等許多生物活性物質(zhì),這些物質(zhì)可對進(jìn)入肝臟的細(xì)菌、病毒、內(nèi)毒素和許多毒性物質(zhì)進(jìn)行代謝解毒,對肝臟起了1定的保護(hù)作用。但同時ROS協(xié)同Kupffer 細(xì)胞激活后分泌的腫瘤壞死因子(TNF-α)等促炎性細(xì)胞因子加重肝臟的缺血再灌注損傷。有實驗認(rèn)為抑制Kupffer細(xì)胞的激活可以減少ROS 的產(chǎn)生及中性粒細(xì)胞的浸潤，從而減輕肝臟的缺血再灌注損傷[11]，但也有實驗相反的意見[12-13]。Ching-Mei Hsu等人的研究認(rèn)為Kupffer細(xì)胞通過誘生型1氧化氮合酶（iNOS）依賴的機(jī)制對肝臟的缺血再灌注損傷早期起到明顯的保護(hù)作用，而1氧化氮（NO）在抗肝臟缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要的作用[14]。1氧化氮合酶（NOS）是NO生成的限速酶，催化L-精氨酸生成瓜氨酸及NO，因此，NOS是NO作用的關(guān)鍵因素。 NOS在肝臟分誘生型1氧化氮合酶（iNOS）和內(nèi)皮型1氧化氮合酶（eNOS），而iNOS的合成能力遠(yuǎn)大于eNOS，應(yīng)激時iNOS是NO合成增多的重要原因。NO通過減低肝內(nèi)血管阻力，改善肝微循環(huán)，從而減輕肝臟缺血再灌注損傷。因此，Kupffer細(xì)胞可能通過激活iNOS，增加NO的合成，從而減輕肝臟的缺血再灌注損傷。
本實驗證實Kupffer細(xì)胞直接介導(dǎo)了乳化異氟醚預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能依賴于NO通路，我們下1步的工作旨在證實Kupffer細(xì)胞與NO通路的關(guān)系，并進(jìn)1步研究異氟醚肝保護(hù)作用的信號傳導(dǎo)通路，希望我們的工作能夠初步揭示異氟醚等吸入麻醉的藥肝保護(hù)的分子機(jī)制，為肝臟手術(shù)合理選擇全麻藥物奠定理論基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn):
[1] Wang C, Weihrauch D, Schwabe DA, et al.Extracellular signal-regulated kinases trigger isoflurane preconditioning concomitant with upregulation of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor expression in rats. Anesth Analg，2006，103: 281-288.
[2] Zheng S，Zuo Z.Isoflurane preconditioning decreases glutamate receptor overactivation-induced Purkinje neuronal injury in rat cerebellar slices. Brain Res，2005，1054:143-151.
[3] Hashiguchi H, Morooka H, Miyoshi H,
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