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肉蓯蓉提取物對帕金森病細胞損傷模型的保護作用
作者：王虎, 李文偉, 蔡定芳, 楊茹【關鍵詞】 肉蓯蓉; 1?甲基?4?苯基?吡啶離子; 帕金森病; 生存率
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是中樞神經系統進行性變性疾病。一旦出現臨床癥狀，其黑質紋狀體系統多巴胺神經元已經減少了60%～80%。盡管神經科學家采取包括左旋多巴制劑在內的各種治療方法，但目前所有的研究都提示無法阻止其進展。生長抑制和DNA損傷誘導基因153（growth arrest? and DNA damage?induced gene 153, GADD153）是調控細胞凋亡的一種重要蛋白，在細胞內質網應激等應激狀態下大量表達并轉位于細胞核［1］。本研究觀察了肉蓯蓉提取物對1?甲基?4?苯基?吡啶離子（1?methyl?4?phenylpyridinium ion, MPP ）介導的SH?SY5Y多巴胺能細胞系損傷的保護作用及對GADD153表達的影響，并探討了其對帕金森病的神經保護作用。
1 材料與方法
1.1 材料 肉蓯蓉提取物，上海市東方科技公司產品，PBS稀釋成10 mg/ml，22 μm濾膜過濾滅菌；MPP ，Sigma公司產品，無菌蒸餾水稀釋成4 mol/L；胎牛血清、達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco's modified eagle's medium, DMEM）、胰蛋白酶，均為Gibco公司產品；GADD153小鼠抗人單克隆抗體，Santa Cruz公司產品；小鼠抗人β?actin單克隆抗體，Sigma公司產品；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT），荷蘭Duchefa公司產品；反轉錄試劑盒（reverse transcriptase?polymerase chain reaction, RT?PCR），MBI公司產品；SH?SY5Y細胞，復旦大學神經生物學國家重點實驗室黃芳老師惠贈。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養及分組 SH?SY5Y細胞每2～3 d用10% DMEM培養液換液1次。待細胞增長至80%融合時，用0.25%胰酶消化細胞，按1×105分瓶傳代，置于5% CO2的細胞培養箱中。實驗用細胞分為對照組、MPP 組和肉蓯蓉提取物不同濃度組。用DMEM培養液將MPP 按1∶10梯度稀釋成400 mmol/L，按1∶100體積比例加入96孔板或6孔板中，使MPP 終濃度分別為0.25、0.5、1、2和4 mmol/L。肉蓯蓉提取物用DMEM培養液按1∶10梯度稀釋成1 mg/ml與10 μg/ml兩個工作濃度。按1∶100加入96孔板或6孔板中，使終濃度分別為1、10和100 μg/ml。6孔板每孔總體積為2 ml，96孔板每孔總體積為200 μl。每項相同實驗均重復3次。
1.2.2 MTT檢測細胞活性
1.2.2.1 MPP 對SH?SY5Y細胞存活率的影響 1×104密度SH?SY5Y細胞200 μl接種于96孔板，24 h后換含MPP 終濃度分別為0.25、0.5、1、2和4 mmol/L的培養液，每濃度3復孔，置于5% CO2培養箱37 ℃孵育，分別于6、12、24和48 h時各孔加入MTT 20 μl，繼續孵育4 h取出培養板。吸棄培養液，每孔加入二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide, DMSO）150 μl充分震蕩10 min，待藍色顆粒完全溶解后用全自動酶標儀（Biorad產品）570 nm處測定吸光度值。
1.2.2.2 肉蓯蓉提取物對MPP 介導的SH?SY5Y細胞損傷的影響 終濃度1 mmol/L MPP 與肉蓯蓉提取物分別為1、10和100 μg/ml同時加入96孔板置5% CO2培養箱37 ℃孵育48 h。其余步驟同1.2.2.1。
1.2.3 RT?PCR檢測GADD153的mRNA表達 終濃度1 mmol/L MPP 與肉蓯蓉提取物分別為1、 10和100 μg/ml，同時加入6孔板置5% CO2培養箱37 ℃孵育48 h。取出6孔培養板，PBS沖洗，按Trizol法提取總RNA。取1 μg RNA，按反轉錄試劑盒說明進行逆轉錄。聚合酶鏈反應總體積為25 μl。引物序列為:GADD153上游引物，5’?GCACCTCCCAGAGCCCTCACTCTCC?3’；下游引物，5’?GTCTACTCCAAGCCTTCCCCCTGCG?3’；β?actin上游引物，5’?ATCGTGGGCCGCCCTAGGCAC?3’；下游引物，5’?TGGCCTTAGGGTTCAGA GGGGC?3’。擴增目的產物的長度分別為422 bp和244 bp。94 ℃預變性5 min。循環參數為：95 ℃變性0.5 min，60 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環。取PCR產物4 μl，電泳后拍照。
1.2.4 Western blotting檢測GADD153蛋白表達 終濃度1 mmol/L MPP 與肉蓯蓉提取物分別為1、10和100 μg/ml，同時加入6孔板置5% CO2培養箱37 ℃孵育48 h。取出6孔培養板，PBS沖洗，加入60 μl蛋白裂解液裂解，超聲震蕩，100 ℃變性10 min。用Lowry法測定樣品蛋白濃度。電泳：積層膠60 V 30min，分離膠120 V 90 min；PVDF膜轉膜110 V 100 min。加1∶50小鼠抗人GADD153單克隆抗體，4 ℃過夜。TBST溶液洗滌3次，10 min/次，加含HRP的兔抗小鼠二抗室溫孵育2 h，化學發光法顯影X膠片。膠片用Alpha Image 950自動掃膠系統得到條帶灰度值。每個樣本的免疫印跡條帶均與同一樣本的β?actin比較后作統計學分析。
1.3 統計學方法 采用SPSS 11.5軟件進行單因素方差分析。計量資料數據用x±s表示。
2 結果
2.1 MPP 對SH?SY5Y細胞存活率的影響 不同濃度MPP 作用SH?SY5Y細胞后，細胞存活率隨MPP 的濃度增加而降低；MPP 1 mmol/L濃度狀態下細胞存活率隨時間增長而降低。呈現明顯的量效與時效關系。見圖1。其中MPP 1 mmol/L組在48 h存活率為（45.30±3.21）%，低于50%。故選用1 mmol/L MPP 作為制作帕金森病細胞模型的處理劑量。
圖1 不同濃度MPP 對SH?SY5Y存活率的影響（略）
Figure 1 Effects of different concentrations of MPP on cell viability of SH?SY5Y
2.2
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