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阿米卡星對(duì)豚鼠耳蝸毛細(xì)胞的損傷作用
【摘要】 目的 研究阿米卡星(amikacin，AMK)在不同給藥時(shí)間內(nèi)對(duì)豚鼠耳蝸毛細(xì)胞的損傷作用，探討AMK的耳毒性。方法 豚鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、AMK 3 d組、AMK 7 d組和AMK 11 d組。采用異硫氰酸四甲基羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽熒光染色方法，并結(jié)合聽(tīng)腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)測(cè)試，觀察用藥前后耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)及聽(tīng)功能的改變。結(jié)果 AMK首先損傷耳蝸底回的外毛細(xì)胞,并且隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，損傷逐漸向頂回發(fā)展，外毛細(xì)胞缺失明顯增多，而AMK對(duì)內(nèi)毛細(xì)胞的損傷要輕于外毛細(xì)胞。聽(tīng)功能改變與形態(tài)學(xué)變化基本一致。結(jié)論 AMK可損傷豚鼠耳蝸毛細(xì)胞，導(dǎo)致聽(tīng)功能下降。
【關(guān)鍵詞】 阿米卡星;豚鼠;耳蝸;聽(tīng)腦干反應(yīng)
Impairment Effect of Amikacin on Cochlear Hair Cells in Guinea PigLIU Shuangyue, WANG Aimei, XU Tao, MU Hua(Department of Physiology, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China)Abstract:Objective To investigate the impairment effect of amikacin (AMK) on cochlear hair cells in guinea pig at different injection time, and to explore ototoxicity of AMK. Methods Guinea pigs were randomly assigned to four groups: control group, AMK 3-day group, 7-day group and 11-day group. Tetramethylrhodamine isothiocyanate-labeled phalloidine staining and auditory brainstem response (ABR) measurement were used to evaluate the changes of hair cells morphology and auditory function before and after the drug treatment. Results Outer hair cells (OHCs) in the basal turns were first impaired by AMK, and the impairment of OHCs developed to the apical turns with time prolonging, and the loss of OHCs was increased significantly. The injury of inner hair cells (IHCs) induced by AMK was lighter than OHCs. Change of auditory function was basically consistent with that of morphology. Conclusions AMK can damage the cochlear hair cells, leading to decline in auditory function.
Key words:amikacin; guinea pig; cochlea; auditory brainstem response
氨基糖苷類抗生素(aminoglycoside antibiotics，AmAn)具有強(qiáng)大的抗革蘭氏陰性桿菌的作用, 加之價(jià)格低廉, 是臨床控制感染的常用抗生素[1]。但是AmAn具有嚴(yán)重的耳毒性，可導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞、前庭毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷[2-3]。阿米卡星(amikacin, AMK)為半合成的AmAn，亦可對(duì)耳蝸毛細(xì)胞造成不可逆性的損傷[4]，然而AMK在不同給藥時(shí)間內(nèi)對(duì)豚鼠耳蝸毛細(xì)胞的損傷特點(diǎn)及其與聽(tīng)功能變化的關(guān)系，目前尚不清楚。據(jù)此，本研究應(yīng)用異硫氰酸四甲基羅丹明(Tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽熒光染色方法，并結(jié)合聽(tīng)腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)測(cè)試，觀察用藥前后豚鼠耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)及聽(tīng)功能的改變，以探討AMK的耳毒性。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
健康白毛紅目豚鼠47 只，體重250～300 g，雌雄不限，耳廓反射靈敏，無(wú)中耳炎，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)期間所有豚鼠均在安靜狀態(tài)下飼養(yǎng)并給予常規(guī)飲食。
1.2 主要試劑和儀器
阿米卡星注射液(0.1 g/mL，批號(hào)090327)由蘇州第六制藥廠生產(chǎn)，TRITC-鬼筆環(huán)肽購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Smart EP & OAE聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)由美國(guó)智聽(tīng)公司生產(chǎn)，ZEISS A1熒光顯微鏡由德國(guó)Zeiss公司生產(chǎn)。
1.3 動(dòng)物分組與耳毒模型建立
將動(dòng)物隨機(jī)分成4 組，即對(duì)照組10 只，AMK 3 d組11 只，AMK 7 d組12 只，AMK 11 d組13 只。以上4 組中，AMK 3 d組、7 d組和11 d組每天肌肉注射AMK 400 mg/kg，分別連續(xù)給藥3 d、7 d和11 d;對(duì)照組則每日肌肉注射等量生理鹽水。用藥期間監(jiān)測(cè)動(dòng)物體重以調(diào)整藥量。
1.4 ABR測(cè)試
各組動(dòng)物于用藥前及停藥后24小時(shí)內(nèi)分別測(cè)試ABR。操作在隔音屏蔽室內(nèi)進(jìn)行。豚鼠用1 %戊巴比妥鈉40 mg/ kg 經(jīng)腹腔麻醉后，將電極的正極置于動(dòng)物顱頂正中皮下，負(fù)極置于給聲側(cè)耳廓后下，接地電極置于對(duì)側(cè)耳廓后下，屏蔽耳機(jī)距測(cè)試豚鼠外耳道口0.5 cm。應(yīng)用Smart EP & OAE聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)給予短純音(tone burst)刺激, 選取4、12、24 kHz 3個(gè)頻率分別進(jìn)行測(cè)試并記錄ABR閾值(聽(tīng)閾)。重復(fù)率39.10次/s，帶通濾波100～1 500 Hz，疊加1 024 次，掃描時(shí)程16.0 ms。聲刺激強(qiáng)度從95 dB SPL開(kāi)始，以5 dB逐次遞減，聽(tīng)閾判定以剛出現(xiàn)ABR Ⅲ波為準(zhǔn)并至少重復(fù)兩次。同一刺激頻率下給藥前后的聽(tīng)閾差值記為ABR閾移。
1.5 耳蝸鋪片TRITC-鬼筆環(huán)肽熒光染色
各組豚鼠于最后一次ABR測(cè)試結(jié)束后，快速斷頭，取出聽(tīng)泡。解剖顯微鏡下去除鐙骨，打開(kāi)前庭窗和蝸窗，用含有4%多聚甲醛的0.1 M PBS(pH 7.4)灌流3 次，并置于該溶液中4 ℃下固定24 h。然后將標(biāo)本置于8 % EDTA中脫鈣2～3 d。PBS漂洗2 次后，于解剖顯微鏡下分離全耳蝸基底膜。將基底膜置于0.25% Triton X-100溶液中浸泡50 min，然后進(jìn)行TRITC-鬼筆環(huán)肽染色45 min。PBS漂洗后分回鋪片，以熒光封固劑封片。熒光顯微鏡下觀察各回毛細(xì)胞損傷情況。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示。各組之間ABR閾移的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 TRITC-鬼筆環(huán)肽熒光染色
熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色呈現(xiàn)紅色熒光，主要定位在外毛細(xì)胞(outer hair cell, OHC)和內(nèi)毛細(xì)胞(inner hair cell, IHC)的靜纖毛、表皮板。此外，Deiter細(xì)胞等亦有絲狀F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)的表達(dá)。
對(duì)照組耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完好，三排OHC的纖毛呈V 形排列整齊，一排IHC的纖毛呈一形排列，耳蝸各回OHC 和IHC均無(wú)缺失(圖1 A)。AMK 3 d組耳蝸底回OHC偶有缺失，而其它回OHC以及各回IHC均無(wú)損傷(圖1B)。AMK 7 d組耳蝸底回OHC的缺失有所增多，并向上發(fā)展到第二回;IHC基本正常(圖1 C)。AMK 11 d組耳蝸底回OHC出現(xiàn)大量缺失并向上延伸到頂回，缺失區(qū)域被Deiter細(xì)胞取代形成網(wǎng)狀瘢痕;IHC出現(xiàn)散在損傷(圖1 D)。
2.2 ABR測(cè)試
連續(xù)給藥后，在各刺激頻率下，AMK 3 d組豚鼠的ABR閾移與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05);AMK 7 d和11 d組豚鼠的ABR閾移與對(duì)照組比較均有顯著性差異 (P<0.01)，并且隨著AMK給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，ABR閾移亦明顯增大(P<0.01)(圖2)。注：▲與對(duì)照組比較P<0.01，*與AMK 3 d組比較P<0.01，△與AMK 7 d組比較P<0.01
3 討 論
F-actin是一種耳蝸毛細(xì)胞骨架蛋白，具有收縮及固定靜纖毛、使OHC運(yùn)動(dòng)、保持毛細(xì)胞形狀以及支持和傳導(dǎo)等多種作用[5]。TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽是一種特殊的F-actin標(biāo)記物，因此可以用于識(shí)別耳蝸毛細(xì)胞，判斷其形態(tài)變化。我們采用耳蝸基底膜鋪片，觀察到經(jīng)TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色呈現(xiàn)紅色熒光，主要定位在OHC和IHC的靜纖毛、表皮板，并且在Deiters等支持細(xì)胞也有F-actin的表達(dá)。這與以往學(xué)者的觀察結(jié)果相一致[6]。
在體和離體實(shí)驗(yàn)表明，AmAn引起的耳蝸毛細(xì)胞損害總是從耳蝸底回開(kāi)始并逐漸向頂回發(fā)展，并且OHC的損傷要先于IHC [7]。本實(shí)驗(yàn)觀察到，AMK首先損傷耳蝸底回的OHC，并且隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，OHC損傷從底回向頂回延伸，OHC缺失數(shù)量逐漸增多，而IHC的損傷要遠(yuǎn)輕于OHC，符合AmAn耳毒性的損傷規(guī)律。丁大連等[7]125-131將bodipy標(biāo)記的慶大霉素投放到耳蝸器官培養(yǎng)系統(tǒng)，觀察到OHC攝取慶大霉素的能力強(qiáng)于IHC，底回OHC攝取慶大霉素的能力強(qiáng)于頂回OHC。因此，豚鼠耳蝸?lái)敾睾偷谆貙?duì)AMK的敏感性不同，可能與耳蝸?lái)敾睾偷谆豋HC對(duì)AMK的攝取能力不同有關(guān)。
巴云鵬等[8]報(bào)道，豚鼠連續(xù)注射AMK 3 d之內(nèi)，聽(tīng)力損傷不明顯，而連續(xù)用藥6 d后，與用藥前相比ABR閾值則有顯著的變化。我們觀察到的結(jié)果與巴云鵬等的研究結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn)連續(xù)注射AMK 3 d后，ABR閾移較對(duì)照組無(wú)明顯變化(P>0.05);而連續(xù)注射AMK 7 d后，ABR閾移明顯增大，并且在連續(xù)注射11 d后，ABR閾移達(dá)到最大，與形態(tài)學(xué)損傷相平行;并且隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，AMK的耳毒性效應(yīng)亦逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的時(shí)效關(guān)系。此外，本實(shí)驗(yàn)還觀察到，雖然AMK 3 d組豚鼠ABR閾移與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，但是耳蝸底回已開(kāi)始有OHC缺失，表明AMK引起耳蝸形態(tài)方面的損傷要早于聽(tīng)功能的改變，同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了AmAn可在內(nèi)耳蓄積，而最后的聽(tīng)力損傷是這種蓄積的結(jié)果[7]125-131。
目前認(rèn)為，AmAn可以與金屬鐵形成AmAn-鐵復(fù)合物，其具有氧化還原活性，可催化體內(nèi)自由基的大量產(chǎn)生。過(guò)多的自由基將打破其在體內(nèi)的平衡，通過(guò)激活調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其相關(guān)基因，使構(gòu)成生物膜的脂質(zhì)或蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子發(fā)生過(guò)氧化，從而引起耳蝸毛細(xì)胞損傷及死亡，最終導(dǎo)致聽(tīng)力喪失。為此，人們嘗試應(yīng)用依布硒啉、甲磺酸去鐵胺(deferoxamine mesylate，DFO)等抗氧化劑來(lái)防護(hù)AMK的耳毒性并取得了較好效果[4]213-217,[8]157-161，表明AMK的耳毒性亦與其促進(jìn)自由基的過(guò)量生成有關(guān)。至于AMK的耳毒性損傷中，自由基通過(guò)激活哪些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑繼而引起耳蝸毛細(xì)胞的死亡，尚需進(jìn)一步深入研究。
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