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益痛清對膜性腎病模型的治療及其機制研究
膜性腎�。∕N，membranous nephropathy）是以致密物在腎小球毛細血管壁上皮下沉積為特征的原位免疫復合物腎炎。近年來大量實踐征明，對MN的治病有較好的療效，尤其在緩解蛋白尿方面。益腎清配方是以黃芪、小薊、川芎、海風藤及車前子五種組成，具有補氣升陽、清熱化瘀、涼血止血、利水清濁的功能，可減輕或緩解MN的蛋白尿、保護腎功能、修復腎小球結構的病理損傷。1
1.1 藥品和拭劑
益腎清，棕紅色粉末，1g粉末相當于13.75g生藥，北京制藥四廠提供。小牛血清白蛋白，帝道生物；大腸桿菌內毒素，北京邦定；生化試劑盒，北京中生。
1.2 動物
雄性新西蘭家兔，1.5-2.0kg，中國藥品生物制品檢定所提供。BALB/C小鼠和C57BL/6J小鼠，18-22g，雌雄各半，雄性Wistar大鼠，150-200g均由北京大學區學部實驗動物科學部提供。
1.3 儀器
ZS-1A型半自動生化分析儀，北京中生；TJ-6離心機和LSl701液閃儀，Beckman；VIS-7220型可見分光光度計，北京瑞利。
2 方法
2.1 益腎情治療陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA）誘導的家免MN。
2.1.1 模型制作
參考Boder1982年所用的方法制備C-BSA并制作模型。42只家兔測定各項血尿生化指標后，隨機選出8只作為正常組，其余動物全部制作模型。首先每只動物iv C-０BSAlmg及大腸桿菌內毒素1μg，一周后開始每天iv C-BSA 10mg，4-7周時劑量加倍。待模型成功后除選兩只模型動物送病理檢查外，其余隨機分為模型組、益腎清10g、5g、2.5g生藥/kg體重劑量組．并給藥治療。
2.1.2 觀察項目
每周動物稱重一次。分別于實驗前、造模成功、藥物治療4周和8周時測定血尿生化指標。動物殺檢，作腎臟病理組織學檢查。
2.2 益腎清對正常小鼠免疫功能的影晌
2.2.1 非特異性免疫——碳粒廓清法
將40只BALB/C小鼠隨機分成益腎清28g、14g、7g生藥/kg體重劑量組和溶劑對照組（0.25%CMC溶液）。連續給藥20天后，小鼠iv印度墨汁0.05ml/10g體重，于1min和5min時分別取血20μl，加到2ml0.1%的碳酸鈉溶液中搖勻比色(680nm)測光密度。 計算廓清指數K和吞噬指數α。
2.2.2 體液免疫——血清溶血素的分光光度測定法
將40只C57BL/6J小鼠分組給藥同非特異性免疫。連續給藥20天后，小鼠ip20%SRBC0.2，免疫后第4天取血，離心得血清，稀釋500倍作溶血反應，比色（540nm）。計算樣品半數溶血值HC50。
2.2.3 細胞免疫——淋巴細胞轉化實驗（3H-TdR摻人法）
將40只C57BL/6J小鼠分組給藥同非特異性免疫。連續給藥20天后，制備小鼠脾細胞懸液，加入培養板，同時加入ConA或LPS，5%CO2培養72小時。終止培養前6小時，加人3H-TdR（終濃度為2μci/ml）。收集細胞，測定樣品放射強度。計算ConA和LPS誘導細胞轉化率。
2.3 益腎清對大鼠的利尿作用
將40只雄性健康Wistar大鼠食18h后，隨機分成益腎清20g、10g、5g生藥/kg體重劑量組和溶劑對照組（生理鹽水），給藥5ml/100g體重。給藥后半小時壓大鼠下腹部排盡余尿，分別放人代謝籠中，收集給藥后1、2、3、4、5小時的尿量。
2.4 益腎清對大鼠血液流流變學的影晌
將40只雄性健康WiStar大鼠隨機分成益腎清20g、10g生藥/體重劑量組、模型組（生理鹽水）和溶劑對照組（生理鹽水），給藥7天。最后一天除溶劑對照組外，其余四組動物sc Adr0.2ml，共2次，兩次間隔6h，間隔中間將功物放入冰水浴中5min給予冷刺激，造成血瘀模型。末次注射Adr18h后，腹主動脈取血，肝素抗凝，B轉子剪切速率由高到為307.20s-1、153.60s-1、61.44s-1、30.72s-1、15.36s-1，不同切變率下測全血表觀粘度（ηb）；分離血漿，307.20s-1下測血漿粘度（ηp）。
2.5 學處理組間比較用t。
3 結果
3.1 益腎清對C-BSA誘導的家兔MN的治療作用
3.1.1 一般情況
模型組動物于造模后不同程度的攝食減少、精神不振、體重減輕、水腫、少尿等現象。給藥后治療組動物水腫逐漸消失，模型組也有自愈趨勢。治療組動物體重高于模型組，但仍低于正常組，各組沒有顯著性差異。
3.1.2 血尿生化指標
造模第3周模型組有動物出現蛋白尿，至造模第7周所有模型組動物均出現蛋白尿，TP24、BUN、CHO比正常組顯著升高（P<0.01），ALB明顯降低(P<0.05)，TRIG也明顯升高(P<0.05)說明模型己經形成。藥物治療4周時，僅益腎清10g生藥/kg體重劑量組的TP24比模型組明顯降低(P<0.05)，其余各組各指標均無明顯交化。治療8周時，治療組的TP24、BUN、TRIG及CHO均比模型組明顯降低（P<０.01或P<0.05），ALB明顯回升（P<0.05），基本恢復至正常水平。
3.1.3 腎臟病理組織學檢查
3.1.3.1 肉眼觀察
實驗結束時，動物殺檢，發現正常組的腎臟和脾臟外觀表面光滑，色澤正常。益腎清各治療組的外觀色澤及大小無明顯變化。而模型組的腎臟兩端鈍圓，中間略隆起，表面不甚光滑，個別腎及脾臟明顯增大，腎臟、脾臟的臟器系數均比正常組明顯增大(P<0.05)。
3.1.3.2 病理改變
正常組免疫熒光檢查陰性，光鏡和電鏡檢查未見異常。模型組IgG、C3沿腎小球毛細血管壁高強度顆粒狀沉積，C3沉積較弱。光鏡檢查可見GBM增厚，系膜增生并有少量粒細胞浸潤，電鏡檢查可見GBM彌漫增厚，上皮下多數電子致密物沉積，上皮細胞足突融合。益腎清各治療組的免疫熒光檢查與模型組相比無差異。10g、5g生藥/kg體重劑量組的光鏡和電鏡檢查已基本恢夏正常，2.5g生藥/體重劑量的的光鏡檢查已恢復正常，但電鏡檢查仍有GBM輕度增厚和節段性上皮細胞足突融合現象。
3.2 益腎清對正常小鼠免疫功能的影響
益腎清28g、14g生藥/kg體重劑量組，小鼠的α、HC50及ConA和LPS誘導細胞轉化的能力比溶劑對照組明顯增強（P＜0.05或P＜0.01）。各劑量組之間有明顯的量效關系。
3.3 益腎清對大鼠的利尿作用
益腎清20g、10g生藥/kg體重劑量組，大鼠1小時尿量及5小時內總尿量與溶劑對照組相比都有顯著增加（P<0.01），提示其有較強的利尿作用。
3.4 益腎清對大鼠血液流變學的影響
血瘀模型組動物的μb值和μp值皆顯著高于溶劑對照相（P＜0.01），標志模型的形成；益腎清20g、10g生藥/kg體重劑量組，大鼠的ηb值和ηp值比模型組均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。說明益腎清能降低血瘀大鼠全血的高、低切變粘度及血漿粘度，提示其有活血化瘀的作用。
4 討論
自1982年以來，Boder等用C-BSA成功誘導了家兔MN之后，陽離子抗原已被廣泛地應用于腎炎的實驗研究。該模型與人類MN頗為相似，具有一定的代表性。它發病率高，重復投好，病理改交一致，適合腎炎發病機理及防治的研究。
本實驗成功地復制了C-BSA誘導的家免MN模型。比較正常組，模型組動物TP24和BUN明顯升高，ALB顯著降低，TRIG和CHO也顯著增加，這些指標的變化與文獻報導一致。依據MN的病理改變可分四期。本突破的模型組IgG、C3沿腎小球毛細血管壁高強度顆粒狀沉積。光鏡檢查可見GBM增厚，系膜增生并有少量粒細胞浸潤，電鏡檢查可見GBM彌漫增厚，上皮下多數電子致密物沉積．上皮細胞足突融合。此癥狀與MNⅢ期病理癥狀相符，說明此實驗模型復制成功。
益腎清的主要成分有：黃芪、小薊、川芎、海風藤及車前子。黃芪主補氣升陽，利水退腫。小薊主清熱解毒，涼血止血，清下焦熱結，可控制炎癥反應。川芎與海風藤協同作用，活血行氣，祛濕通絡，可改善毛細血管循環。車前子主利水，分清濁，可發揮疏通尿路作用。為了更深一步的研究，我們觀察了益腎清對大鼠的尿量、血液流變學及正常小鼠免疫功能的影響，發現該藥具有較強的增強免疫、利尿和活血化瘀功能。說明益腎清對MN的治療可能是通過利尿、活血化瘀或免疫增強作用等多種機制發揮作用的，但確切機制還需進一步驗證。
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