益痛清對(duì)膜性腎病模型的治療及其機(jī)制研究
膜性腎�。∕N，membranous nephropathy）是以致密物在腎小球毛細(xì)血管壁上皮下沉積為特征的原位免疫復(fù)合物腎炎。近年來(lái)大量實(shí)踐征明，對(duì)MN的治病有較好的療效，尤其在緩解蛋白尿方面。益腎清配方是以黃芪、小薊、川芎、海風(fēng)藤及車前子五種組成，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、清熱化瘀、涼血止血、利水清濁的功能，可減輕或緩解MN的蛋白尿、保護(hù)腎功能、修復(fù)腎小球結(jié)構(gòu)的病理?yè)p傷。1
1.1 藥品和拭劑
益腎清，棕紅色粉末，1g粉末相當(dāng)于13.75g生藥，北京制藥四廠提供。小牛血清白蛋白，帝道生物；大腸桿菌內(nèi)毒素，北京邦定；生化試劑盒，北京中生。
1.2 動(dòng)物
雄性新西蘭家兔，1.5-2.0kg，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。BALB/C小鼠和C57BL/6J小鼠，18-22g，雌雄各半，雄性Wistar大鼠，150-200g均由北京大學(xué)區(qū)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。
1.3 儀器
ZS-1A型半自動(dòng)生化分析儀，北京中生；TJ-6離心機(jī)和LSl701液閃儀，Beckman；VIS-7220型可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京瑞利。
2 方法
2.1 益腎情治療陽(yáng)離子化牛血清白蛋白（C-BSA）誘導(dǎo)的家免MN。
2.1.1 模型制作
參考Boder1982年所用的方法制備C-BSA并制作模型。42只家兔測(cè)定各項(xiàng)血尿生化指標(biāo)后，隨機(jī)選出8只作為正常組，其余動(dòng)物全部制作模型。首先每只動(dòng)物iv C-０BSAlmg及大腸桿菌內(nèi)毒素1μg，一周后開(kāi)始每天iv C-BSA 10mg，4-7周時(shí)劑量加倍。待模型成功后除選兩只模型動(dòng)物送病理檢查外，其余隨機(jī)分為模型組、益腎清10g、5g、2.5g生藥/kg體重劑量組．并給藥治療。
2.1.2 觀察項(xiàng)目
每周動(dòng)物稱重一次。分別于實(shí)驗(yàn)前、造模成功、藥物治療4周和8周時(shí)測(cè)定血尿生化指標(biāo)。動(dòng)物殺檢，作腎臟病理組織學(xué)檢查。
2.2 益腎清對(duì)正常小鼠免疫功能的影晌
2.2.1 非特異性免疫——碳粒廓清法
將40只BALB/C小鼠隨機(jī)分成益腎清28g、14g、7g生藥/kg體重劑量組和溶劑對(duì)照組（0.25%CMC溶液）。連續(xù)給藥20天后，小鼠iv印度墨汁0.05ml/10g體重，于1min和5min時(shí)分別取血20μl，加到2ml0.1%的碳酸鈉溶液中搖勻比色(680nm)測(cè)光密度。 計(jì)算廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α。
2.2.2 體液免疫——血清溶血素的分光光度測(cè)定法
將40只C57BL/6J小鼠分組給藥同非特異性免疫。連續(xù)給藥20天后，小鼠ip20%SRBC0.2，免疫后第4天取血，離心得血清，稀釋500倍作溶血反應(yīng)，比色（540nm）。計(jì)算樣品半數(shù)溶血值HC50。
2.2.3 細(xì)胞免疫——淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（3H-TdR摻人法）
將40只C57BL/6J小鼠分組給藥同非特異性免疫。連續(xù)給藥20天后，制備小鼠脾細(xì)胞懸液，加入培養(yǎng)板，同時(shí)加入ConA或LPS，5%CO2培養(yǎng)72小時(shí)。終止培養(yǎng)前6小時(shí)，加人3H-TdR（終濃度為2μci/ml）。收集細(xì)胞，測(cè)定樣品放射強(qiáng)度。計(jì)算ConA和LPS誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。
2.3 益腎清對(duì)大鼠的利尿作用
將40只雄性健康Wistar大鼠食18h后，隨機(jī)分成益腎清20g、10g、5g生藥/kg體重劑量組和溶劑對(duì)照組（生理鹽水），給藥5ml/100g體重。給藥后半小時(shí)壓大鼠下腹部排盡余尿，分別放人代謝籠中，收集給藥后1、2、3、4、5小時(shí)的尿量。
2.4 益腎清對(duì)大鼠血液流流變學(xué)的影晌
將40只雄性健康WiStar大鼠隨機(jī)分成益腎清20g、10g生藥/體重劑量組、模型組（生理鹽水）和溶劑對(duì)照組（生理鹽水），給藥7天。最后一天除溶劑對(duì)照組外，其余四組動(dòng)物sc Adr0.2ml，共2次，兩次間隔6h，間隔中間將功物放入冰水浴中5min給予冷刺激，造成血瘀模型。末次注射Adr18h后，腹主動(dòng)脈取血，肝素抗凝，B轉(zhuǎn)子剪切速率由高到為307.20s-1、153.60s-1、61.44s-1、30.72s-1、15.36s-1，不同切變率下測(cè)全血表觀粘度（ηb）；分離血漿，307.20s-1下測(cè)血漿粘度（ηp）。
2.5 學(xué)處理組間比較用t。
3 結(jié)果
3.1 益腎清對(duì)C-BSA誘導(dǎo)的家兔MN的治療作用
3.1.1 一般情況
模型組動(dòng)物于造模后不同程度的攝食減少、精神不振、體重減輕、水腫、少尿等現(xiàn)象。給藥后治療組動(dòng)物水腫逐漸消失，模型組也有自愈趨勢(shì)。治療組動(dòng)物體重高于模型組，但仍低于正常組，各組沒(méi)有顯著性差異。
3.1.2 血尿生化指標(biāo)
造模第3周模型組有動(dòng)物出現(xiàn)蛋白尿，至造模第7周所有模型組動(dòng)物均出現(xiàn)蛋白尿，TP24、BUN、CHO比正常組顯著升高（P<0.01），ALB明顯降低(P<0.05)，TRIG也明顯升高(P<0.05)說(shuō)明模型己經(jīng)形成。藥物治療4周時(shí)，僅益腎清10g生藥/kg體重劑量組的TP24比模型組明顯降低(P<0.05)，其余各組各指標(biāo)均無(wú)明顯交化。治療8周時(shí)，治療組的TP24、BUN、TRIG及CHO均比模型組明顯降低（P<０.01或P<0.05），ALB明顯回升（P<0.05），基本恢復(fù)至正常水平。
3.1.3 腎臟病理組織學(xué)檢查
3.1.3.1 肉眼觀察
實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，動(dòng)物殺檢，發(fā)現(xiàn)正常組的腎臟和脾臟外觀表面光滑，色澤正常。益腎清各治療組的外觀色澤及大小無(wú)明顯變化。而模型組的腎臟兩端鈍圓，中間略隆起，表面不甚光滑，個(gè)別腎及脾臟明顯增大，腎臟、脾臟的臟器系數(shù)均比正常組明顯增大(P<0.05)。
3.1.3.2 病理改變
正常組免疫熒光檢查陰性，光鏡和電鏡檢查未見(jiàn)異常。模型組IgG、C3沿腎小球毛細(xì)血管壁高強(qiáng)度顆粒狀沉積，C3沉積較弱。光鏡檢查可見(jiàn)GBM增厚，系膜增生并有少量粒細(xì)胞浸潤(rùn)，電鏡檢查可見(jiàn)GBM彌漫增厚，上皮下多數(shù)電子致密物沉積，上皮細(xì)胞足突融合。益腎清各治療組的免疫熒光檢查與模型組相比無(wú)差異。10g、5g生藥/kg體重劑量組的光鏡和電鏡檢查已基本恢夏正常，2.5g生藥/體重劑量的的光鏡檢查已恢復(fù)正常，但電鏡檢查仍有GBM輕度增厚和節(jié)段性上皮細(xì)胞足突融合現(xiàn)象。
3.2 益腎清對(duì)正常小鼠免疫功能的`影響
益腎清28g、14g生藥/kg體重劑量組，小鼠的α、HC50及ConA和LPS誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力比溶劑對(duì)照組明顯增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01）。各劑量組之間有明顯的量效關(guān)系。
3.3 益腎清對(duì)大鼠的利尿作用
益腎清20g、10g生藥/kg體重劑量組，大鼠1小時(shí)尿量及5小時(shí)內(nèi)總尿量與溶劑對(duì)照組相比都有顯著增加（P<0.01），提示其有較強(qiáng)的利尿作用。
3.4 益腎清對(duì)大鼠血液流變學(xué)的影響
血瘀模型組動(dòng)物的μb值和μp值皆顯著高于溶劑對(duì)照相（P＜0.01），標(biāo)志模型的形成；益腎清20g、10g生藥/kg體重劑量組，大鼠的ηb值和ηp值比模型組均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。說(shuō)明益腎清能降低血瘀大鼠全血的高、低切變粘度及血漿粘度，提示其有活血化瘀的作用。
4 討論
自1982年以來(lái)，Boder等用C-BSA成功誘導(dǎo)了家兔MN之后，陽(yáng)離子抗原已被廣泛地應(yīng)用于腎炎的實(shí)驗(yàn)研究。該模型與人類MN頗為相似，具有一定的代表性。它發(fā)病率高，重復(fù)投好，病理改交一致，適合腎炎發(fā)病機(jī)理及防治的研究。
本實(shí)驗(yàn)成功地復(fù)制了C-BSA誘導(dǎo)的家免MN模型。比較正常組，模型組動(dòng)物TP24和BUN明顯升高，ALB顯著降低，TRIG和CHO也顯著增加，這些指標(biāo)的變化與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致。依據(jù)MN的病理改變可分四期。本突破的模型組IgG、C3沿腎小球毛細(xì)血管壁高強(qiáng)度顆粒狀沉積。光鏡檢查可見(jiàn)GBM增厚，系膜增生并有少量粒細(xì)胞浸潤(rùn)，電鏡檢查可見(jiàn)GBM彌漫增厚，上皮下多數(shù)電子致密物沉積．上皮細(xì)胞足突融合。此癥狀與MNⅢ期病理癥狀相符，說(shuō)明此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛷?fù)制成功。
益腎清的主要成分有：黃芪、小薊、川芎、海風(fēng)藤及車前子。黃芪主補(bǔ)氣升陽(yáng)，利水退腫。小薊主清熱解毒，涼血止血，清下焦熱結(jié)，可控制炎癥反應(yīng)。川芎與海風(fēng)藤協(xié)同作用，活血行氣，祛濕通絡(luò)，可改善毛細(xì)血管循環(huán)。車前子主利水，分清濁，可發(fā)揮疏通尿路作用。為了更深一步的研究，我們觀察了益腎清對(duì)大鼠的尿量、血液流變學(xué)及正常小鼠免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)該藥具有較強(qiáng)的增強(qiáng)免疫、利尿和活血化瘀功能。說(shuō)明益腎清對(duì)MN的治療可能是通過(guò)利尿、活血化瘀或免疫增強(qiáng)作用等多種機(jī)制發(fā)揮作用的，但確切機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。
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