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矽肺模型大鼠肺間質成纖維細胞MMP
作者：王海濤，劉昊，顏京霞，田艷霞，江小華，高俊玲
【關鍵詞】 肺間質纖維化
Expression of matrix metalloproteinase2 and 9 in pulmonary fibroblasts of silicotic fibrosis rat model
【Abstract】 AIM: To study the expression of MMP2 and MMP9 in fibroblasts of rat silicotic fibrosis model and its significance. METHODS: Fifty pathogenfree Wistar rats were randomly divided into experimental group and control group. Experimental group was instillated with SiO2, while control group with normal saline. Pulmonary interstitial fibroblasts were isolated on day 1, 3, 7, 14 and 28 after SiO2 exposure. The protein and mRNA expression of MMP2 was evaluated by immunocytochemistry and RTPCR. RESULTS: ①The MMP2 protein expression in fibroblasts increased on day 1 after SiO2 exposure and reached 3.887 times（t=23.667，P<0.001） that of control group on day 7. The expression of MMP9 protein also increased on day 1 after SiO2 exposure and reached 3.103 times that of control group（t=11.399, P<0.001）on day 7. ② The mRNA expression of MMP2 and MMP9 was enhanced in fibroblasts at 24 h after SiO2 instillation. CONCLUSION: The expression of MMP2 and MMP9 in fibroblasts is upregulated in silicotic fibrosis model.
【Keywords】 matrix metalloproteinase; fibroblast cells; pulmonary fibrosis; silicotic fibrosis
【摘要】 目的:探討肺間質成纖維細胞MMP2和MMP9在SiO2致肺纖維化中的表達及意義. 方法: 清潔級Wistar大鼠50只，隨機分為對照組和實驗組，實驗組氣管內注射SiO2懸液，對照組代以等劑量生理鹽水. 注射后1，3，7，14和28 d分離和提取肺間質成纖維細胞，應用免疫細胞化學和逆轉錄多聚酶鏈式反應（RTPCR）方法，觀察其MMP2，MMP9蛋白及其mRNA的動態變化. 結果:①SiO2作用后1 d成纖維細胞MMP2表達增高，7 d達高峰，為對照組的3.887倍（t=23.667，P<0.001）；MMP9在SiO2作用后1 d表達增高，7 d達對照組的3.103倍（t=11.399，P<0.001）；②MMP2 mRNA和MMP9 mRNA的轉錄從SiO2作用后1 d就開始升高. 結論:受SiO2刺激后，肺間質成纖維細胞上調MMP2和MMP9的表達，損傷肺泡基底膜，啟動肺纖維化的發生.
【關鍵詞】 基質金屬蛋白酶；肺間質成纖維細胞；肺間質纖維化；矽肺
0引言
基質金屬蛋白酶及其組織抑制物（matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, MMP/TIMP）是肺纖維化效應細胞分泌的生物活性分子，在細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的合成和降解中具有重要意義. 在MMP家族中，MMP2和MMP9的特異性底物主要是Ⅳ型膠原，而后者是肺泡壁基底膜的重要成分. 肺泡上皮細胞和基底膜的損傷是肺間質纖維化過程的關鍵事件［1］. 我們在SiO2所致肺纖維化形成過程中的不同階段分離肺成纖維細胞（lung fibroblast,LFb），應用免疫細胞化學和逆轉錄多聚酶鏈式反應（RTPCR）對MMP2和MMP9蛋白及其mRNA進行探討如下.
1和方法
1．1材料
健康雄性SD大鼠，體質量（180±40）g，由華北煤炭院醫學實驗動物中心提供. SiO2粉塵（中國醫學科學院勞衛所）；小鼠抗波形蛋白（vimentin） mAb及免疫組化染色SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；羊抗MMP2和羊抗MMP9多克隆抗體（Santa Cruz產品）；免疫組化SP試劑盒（北京中山生物技術有限公司）；Trizol試劑盒（Gibco公司產品）；逆轉錄反應試劑盒（Takara公司產品）；PCR擴增試劑盒和DNA梯度Marker（Sangon公司）；引物由Sangon公司合成，PAGE純化. MMP2引物序列為5′CTA TTC TGT CAG CAC TTT GG3′（sense），5′CAG ACT TTG GTT CTC CAA CTT3′（antisense），擴增片段長度為303 bp. MMP9引物序列為5′AAA TGT GGG TGT ACA CAG GC3′ （sense），5′TTC ACC CGG TTG TGG AAA CT3′（antisense），擴增片段長度為303 bp. 內參照采用GAPDH，引物序列為5′CTT CTG AGT GGC AGT GAT GG3′ （sense），5′TGG CAC AGT CAA GGC TGA GA3′（antisense），擴增片段長度為389 bp.
1．2方法
大鼠50只，隨機等分為實驗組和對照組. 實驗組大鼠乙醚麻醉后，采用經氣管染SiO2粉塵法復制矽肺模型［2］. SiO2粉塵懸液50 g/L，生理鹽水配制，每只大鼠1 mL. 對照組在相同條件下氣管內注入生理鹽水1 mL. 染塵后1，3，7，14，28 d分別處死實驗組和對照組各5只，無菌操作取肺. 采用酶消化法結合組織塊貼壁培養法分離和培養細胞. 用SABC法檢測細胞的波形蛋白（vimentin）的表達，以鑒定分離培養的細胞為肺間質成纖維細胞.
1．2．1免疫細胞化學檢測MMP2和MMP9將第4代LFb接種于載玻片上，貼壁后，血清饑餓使其同步化，按照SP試劑盒說明，作細胞爬片的免疫細胞化學染色. 羊抗鼠MMP2一抗和羊抗鼠MMP9一抗1∶150稀釋. DAB顯色. PBS代替一抗作陰性對照. 染色結果經Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統（北航）作圖像分析，胞質中的棕褐色顆粒為表達陽性，表達強度用積分吸光度（A）表示.
1．2．2RTPCR檢測MMP2和MMP9 mRNA按照Trizol試劑盒說明提取細胞總RNA. 逆轉錄步驟參照說明書進行，反應條件42℃ 15 min，95℃ 2 min；PCR擴增反應步驟參照說明書，反應條件94℃，45 s；58℃，45 s；72℃，80 s；30個循環. 擴增產物進行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳. 電泳條帶采用凝膠成像系統做積分吸光度（A值）測定，以實驗組和對照組MMP2, MMP9與GAPDH的A比值的表示MMP2 mRNA的相對表達量.
學處理： 數據以x±s表示，用SPSS 11.0統計軟件包進行組間t，方差不齊時用t′檢驗.
2結果
2．1MMP2和MMP9的表達矽肺模型組大鼠LFb MMP2和MMP9表達比對照組明顯增強，7 d為表達高峰(Tab 1, Fig 1).表1肺間質成纖維細胞MMP2, MMP9蛋白及mRNA表達的動態變化（略）
2．2MMP2和MMP9 mRNA的變化模型組LFb MMP2和MMP9 mRNA表達與對照組比較明顯增高(Tab 1).
3討論
長期吸入SiO2粉塵引起的矽肺，其主要病理改變是矽結節形成和間質纖維化, 但其發病機制尚未完全闡明. 目前認為,吸入SiO2粉塵后，肺泡巨噬細胞、中性粒細胞等分泌多種細胞因子，導致肺泡炎的發生發展，最終引起進行性肺間質纖維化. 纖維化的發生是細胞外基質合成與降解不平衡的結果. 近年來，細胞外基質降解系統尤其是基質金屬蛋白酶及其組織抑制因子功能紊亂，在纖維化疾病中愈來愈受到重視. 研究表明，基質金屬蛋白酶在細胞外基質的降解與重塑的病理生理發展過程中起關鍵性作用. MMP2和MMP9的特異性底物是Ⅳ型膠原，而后者是肺泡壁基底膜的重要成分. 由致病因素引起的MMP2,MMP9高表達在破壞肺泡上皮細胞基底膜繼而纖維母細胞侵入肺泡腔引起肺纖維化中起作用［3］. 動物實驗和臨床均表明，在肺纖維化中有MMP2和MMP9的高表達［4］.
本結果顯示,注入SiO2粉塵后1 d MMP2蛋白表達即顯著升高，達到對照組的1.245倍（t=2.660，P<0.05），7 d達到高峰，為對照組的3.887倍（t=23.667，P<0.01），28 d仍顯著高于對照組（t=5.621，P<0.01）. 其mRNA表達亦明顯增高. MMP9及其mRNA表達和對照組比較在1，3，7 d顯著升高. 提示在肺間質纖維化早中期，肺間質成纖維細胞是MMP2和MMP9來源之一. 肺間質成纖維細胞可能通過高表達MMP2和MMP9，啟動了介于炎癥細胞之間、炎癥細胞與肺組織 結構細胞之間以及細胞與細胞外基質之間持續進行性發展的“cross talking”［5］. 研究表明，在肺纖維化模型中肺間質成纖維細胞可以高表達MMP2，亦有學者對肺纖維化患者的肺成纖維細胞進行體外培養，亦發現其具有顯著增高的MMP9表達［6］. 可見，肺間質成纖維細胞不單純是肺纖維化的效應細胞. 注入SiO2粉塵后，肺間質成纖維細胞通過表達MMP2和MMP9，參與肺泡基底膜的損傷，從而參與啟動肺纖維化.
【參考文獻】
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