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過量碘化物對原代培養(yǎng)的豬甲狀腺細(xì)胞凋亡的作用
作者：田英娟，田園，劉超，葉亮
【摘要】 目的 觀察過量碘化物對原代培養(yǎng)的豬甲狀腺細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，并對機(jī)制作初步探討。方法 取健康的豬甲狀腺細(xì)胞培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的碘化鉀(KI)，觀察細(xì)胞的形態(tài)改變；瓊脂糖凝膠電泳、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞DNA的降解；MDA法測定細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化程度。結(jié)果 加入KI 24h后，熒光染色鏡下觀察可見凋亡細(xì)胞；瓊脂糖凝膠電泳呈梯狀帶；流式細(xì)胞術(shù)見亞二倍體（凋亡）峰，細(xì)胞凋亡率和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物隨碘化物濃度的升高而升高(P<0.05)。結(jié)論 過量碘化物誘導(dǎo)了原代培養(yǎng)的豬甲狀腺細(xì)胞凋亡，可能通過活性氧機(jī)制啟動凋亡。
【關(guān)鍵詞】 甲狀腺細(xì)胞凋亡；過量碘；活性氧
【Abstract】 Objective To study the effect of excess iodide on the primary cultured pig and its mechnism. Methods We employed the primary cultured pig thyroid cells. The apoptosis was evaluated by AQ-stained fluorescin， DNA ladder by gel electrophoresis and subdiploidy by propidium iodide-stained flow cytometry. The level of lipid peroxide under KI treatment was determined by measuring the production of thiobarbituric acid reactive substances.Results Thyroid cells treated with iodide excess at different concentration underwent apoptosis. Iodide displayed a dose-dependent apoptosis index and a dose-dependent generation of TBARS levels.Conclusion Iodide excess induce the apoptosis in the primary cultured pig thyroid cells. This type of apoptosis seems to be activated by reactive oxygen species.
【Key words】 thyroid cell apoptosis；iodide excess；reactive oxygen species
碘化物在人類的日常生活中具有重要的意義。過量碘化物對甲狀腺及培養(yǎng)的甲狀腺細(xì)胞的毒性效應(yīng)早已證實(shí)，近幾十年來從凋亡角度對這種作用作了一些研究［1～3］。目前過量碘化物對體外培養(yǎng)的豬甲狀腺細(xì)胞的作用未見報(bào)道，其誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)觀察過量碘化物對原代培養(yǎng)的豬甲狀腺細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，并對凋亡機(jī)制作初步研究。
1 與方法
1.1 主要試劑與儀器 F-12培養(yǎng)基為美國Gibco公司生產(chǎn)，促甲狀腺激素(TSH)、膠原酶為美國sigma公司生產(chǎn)，熒光顯微鏡為日本Olympus BH-2型，流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品。
1.2 甲狀腺細(xì)胞培養(yǎng) 取適量的豬甲狀腺組織(錦州肉聯(lián)廠提供)PBS沖洗，剪碎倒入帶有磁力攪拌子的三角燒瓶中，加入雙酶消化；每隔15～20min取出上2/3的消化液，漂洗制成細(xì)胞懸液；消化完畢將細(xì)胞懸液通過100目篩網(wǎng)過濾，調(diào)整細(xì)胞數(shù)106/ml，接種于培養(yǎng)板上；置5%二氧化碳孵箱，在10%FCS、1u/LTSH的F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2～3天更換培養(yǎng)基。
1.3 實(shí)驗(yàn)分組 甲狀腺細(xì)胞正常培養(yǎng)24h后，加入處理因素并分組�？瞻讓φ战M：不加其他處理因素；陽性對照組：放線菌酮（CHX）2×10-3g/L(終濃度)；陰性對照組：氯化鉀60mmol/L(終濃度)；實(shí)驗(yàn)組：不同濃度的KI。所用濃度根據(jù)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并參考文獻(xiàn)資料［1］。
1.4 甲狀腺細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡下，觀察各組培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長狀況。培養(yǎng)24h后加入處理因素，再過24h收集細(xì)胞，經(jīng)吖啶橙（AO）染色在熒光顯微鏡下觀察。
1.5 瓊脂糖凝膠電泳 取實(shí)驗(yàn)組（KI 1mmol/L，60mmol/L， 100mmol/L）、陰性對照組、陽性對照組同時(shí)做電泳。加入處理因素再培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞，分別加入細(xì)胞裂解液、RNA酶、樣品緩沖液混勻后，加樣于1%瓊脂糖凝膠的樣品孔，電泳結(jié)束觀察并記錄。
1.6 細(xì)胞凋亡率和脂質(zhì)過氧化測定 實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)不同的濃度組，加入KI再培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。用預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，加入碘化丙啶（PI）染液后，流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞DNA的含量分布；超聲震碎細(xì)胞，按南京建成生物公司提供的方法檢測MDA含量。亞二倍體峰（凋亡）細(xì)胞比率表示細(xì)胞的凋亡率。
1.7 學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5進(jìn)行單因素方差分析。
2 結(jié)果
2.1 甲狀腺細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 甲狀腺細(xì)胞是腺體上皮細(xì)胞，20～24h貼壁生長，細(xì)胞呈多邊形、圓形；２～3天可見典型的濾泡結(jié)構(gòu)，5～6天細(xì)胞鋪滿單層。加入KI ６～8h濾泡結(jié)構(gòu)開始改變，細(xì)胞有分散傾向；24h后無典型濾泡結(jié)構(gòu)，有的細(xì)胞變小、變圓，核內(nèi)出現(xiàn)碎片；48h后可見漂浮的細(xì)胞，以后改變不明顯。
2.2 細(xì)胞凋亡的熒光顯微鏡觀察 陽性對照組及實(shí)驗(yàn)組的凋亡細(xì)胞核內(nèi)可見致密濃染的黃綠色染色，呈圓形、月牙形，可見發(fā)泡現(xiàn)象及凋亡小體。陰性對照組細(xì)胞核內(nèi)呈均勻的黃綠色染色。
2.3 瓊脂糖凝膠電泳 電泳結(jié)果顯示：陽性對照組、KI組見明顯的凋亡條帶，呈云梯狀；高濃度的梯狀帶較明顯。陰性對照組無云梯狀帶(見圖1)。
2.4 細(xì)胞凋亡率測定 流式細(xì)胞儀分析表明在不同KI濃度組DNA直方圖上顯示：隨濃度的升高二倍體峰（G0/ G1期）細(xì)胞減少（P<0.05），亞二倍體峰（凋亡）細(xì)胞升高（P<0.05）。見表1。
2.5 脂質(zhì)過氧化程度測定 培養(yǎng)細(xì)胞加入過量的KI后，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的量隨濃度的升高而升高（P<0.05）。見表2。
表1 在不同濃度KI作用下凋亡細(xì)胞（Ap）、G0／G1細(xì)胞所占比率 （%，±s）
注：不同濃度的KI組間比較，*P<0.05，△P＞0.05
表2 不同濃度碘化鉀作用下MDA含量 （nmol/mg，±s）
注： 不同濃度的碘化鉀組間比較，*P<0.05
2.6 相關(guān)性分析 從培養(yǎng)甲狀腺細(xì)胞的細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA與細(xì)胞凋亡率的散點(diǎn)圖上可見，細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平與細(xì)胞凋亡率呈顯著正相關(guān)，r=0.993，P<0.01。
3 討論
自然界中與甲狀腺激素合成有關(guān)的碘主要是碘化鈉、碘化鉀。碘化物在人類的日常生活中具有重要的意義，但過量碘化物對在體甲狀腺組織及培養(yǎng)的甲狀腺細(xì)胞都存在毒性效應(yīng)［1～4］。本實(shí)驗(yàn)豬甲狀腺細(xì)胞培養(yǎng)24h，加入過量碘化鉀，甲狀腺濾泡及細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)改變，細(xì)胞發(fā)生凋亡，反映了過量碘化物的細(xì)胞毒性效應(yīng)。過量碘化物的這種毒性效應(yīng)機(jī)制至今尚未闡明。
細(xì)胞壞死和凋亡是細(xì)胞兩種截然不同的死亡方式，但在某些情況下二者的區(qū)分較困難，尤其對培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)以細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)時(shí)，開始細(xì)胞以凋亡為特征，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長或誘導(dǎo)劑濃度的增加，凋亡后期的細(xì)胞發(fā)生繼發(fā)性死亡的改變，稱為細(xì)胞凋亡性壞死，即凋亡細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、空泡化，甚至胞膜發(fā)生破裂［5］。過量碘化物引起培養(yǎng)甲狀腺細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、電位的改變，是細(xì)胞凋亡在不同階段的表現(xiàn)形式［1～4］。Vitale等研究過量碘化鉀對體外培養(yǎng)的甲狀腺TAD-2細(xì)胞系及人正常甲狀腺細(xì)胞的作用，認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的甲狀腺細(xì)胞凋亡和壞死，是一個(gè)細(xì)胞凋亡的過程，壞死是細(xì)胞凋亡性壞死［1］。本實(shí)驗(yàn)中過量碘化鉀誘導(dǎo)了原代培養(yǎng)的豬甲狀腺細(xì)胞凋亡；且細(xì)胞凋亡率隨濃度的升高而上升，呈劑量依賴關(guān)系，與Vitale的報(bào)道相符。
人們早已發(fā)現(xiàn)丙基硫氧嘧啶、甲硫咪唑、高氯酸等抑制過量碘化物對甲狀腺細(xì)胞的毒性作用，阻滯細(xì)胞的壞死和凋亡［1，4］。推斷碘離子的代謝過程可能與碘化物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞可濃縮I-，過氧化物酶在氧化I-過程中生成活性很高的自由基引起質(zhì)膜中脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致線粒體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生并釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中MDA、細(xì)胞凋亡率均隨碘化物濃度的升高而升高，推測加入過量碘化鉀后，質(zhì)膜中脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致活性氧的釋放，誘導(dǎo)培養(yǎng)的甲狀腺細(xì)胞凋亡，其途徑可能通過活性氧機(jī)制。過量碘化物誘導(dǎo)的甲狀腺細(xì)胞凋亡的過程中，檢測到的細(xì)胞色素C、活性 氧、Caspase酶、Bcl家族蛋白提示了線粒體在這種細(xì)胞凋亡中可能起重要的作用［1，2，6］。
從左到右陰性對照組、陽性對照組、實(shí)驗(yàn)組(KI1、60、100mmol/L)?
圖1 對照組、陽性組及實(shí)驗(yàn)組瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果
【參考文獻(xiàn)】
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