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研究凋亡素參與正常細胞核蛋白表達差異
1．引言
凋亡素能夠特異引起腫瘤細胞與轉化細胞的凋亡，這種細胞凋亡是非P53 依賴的，而不能夠導致正常細胞的凋亡，這與凋亡素的核定位有關。凋亡素是一種在細胞質與細胞核之間穿梭的蛋白。無論是在腫瘤細胞還是正常細胞內，凋亡素都能夠通過核定位信號進入細胞核。然而在腫瘤細胞中，凋亡素被修飾，導致出核信號的失活，定位在細胞核內，引起腫瘤細胞的凋亡；而在正常細胞中，凋亡素又通過出核信號出核，定位在細胞漿內，不引起正常細胞的凋亡。
綜上所述，腫瘤細胞與正常細胞之間的蛋白表達一定存在著某種差異，使得凋亡素在腫瘤細胞中被特異地修飾。本實驗通過蛋白質組學的方法來尋找腫瘤細胞與正常細胞核內的蛋白表達差異，以期望能夠進一步探討凋亡素誘導腫瘤細胞特異凋亡的機制。
2．材料和方法
2.1 實驗材料PureyieldTM Plasmid Midiprep System(Promega)、RPMI1640 細胞培養基、新生牛血清（GIBCO）、轉染試劑LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen)、蛋白酶抑制劑（sigma）、pEGFP-C1、pEGFP-C1-apoptin 由倫敦大學醫學院Tavassoli 博士惠贈，JM109 菌株由本室保存，HepG2 細胞、L02 細胞由本校遺傳教研室饋贈。
2.2 pEGFP-C1-apoptin 載體的提取按照 Promega 公司PureyieldTM Plasmid Midiprep System 提取試劑盒進行質粒的提取。
2.3 細胞培養用含 RPMI1640、10%新生牛血清的培養液，置37℃、5%CO2 及飽和濕度的恒溫箱中培養HepG2 細胞、L02 細胞，每2d 傳代一次。
2.4 細胞轉染進行 24 孔板貼壁細胞的瞬時轉染，將pEGFP-C1-apoptin 質粒分別轉染進HepG2 和L02兩種細胞。
2.5 激光共聚焦檢測apoptin 定位轉染后24、 48h 將 24 孔細胞培養板取出,在各組細胞的培養基中加入 Hoechst 33342染液(終濃度為 10μ g/ml), 37℃恒溫避光染色 15min, PBS 洗3 次,去除未結合的 Hoechst33342, 激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察,拍照。
2.6 細胞核蛋白提取用含 RPMI1640、10%新生牛血清的培養液，置37℃、5%CO2 及飽和濕度的恒溫箱中培養轉染24h、48h 后的HepG2 細胞、L02 細胞。收集上述細胞，常規消化，用PBS(ph7 .2)洗1 次，4℃ 1080rpm 離心5min。棄上清，細胞壓積加緩沖液A 400μl，蛋白酶抑制劑2μl，混懸，冰上腫脹15 min，再加10％ NP-40 50μl，渦動10 s。10000 g，離心20 s (室溫)。仔細棄全部上清，加蛋白酶抑制劑2μl，緩沖液B 400μl，混懸，冰浴1h，間以攪拌。超聲去核酸，工作時間2s，間歇時間10s，功率200w。4℃，14 000 g，1h，吸取上清，分裝。用Bradford 法測蛋白濃度。
2.7 細胞核蛋白的雙向電泳將提好的細胞核蛋白樣品分裝，送公司進行雙向電泳。
3．實驗及結果分析
3.1 激光共聚焦檢測凋亡素定位結果激光共聚焦熒光顯微鏡觀察凋亡素轉染24 及48 小時后，在腫瘤細胞與正常細胞的定位情況。轉染24 小時后，凋亡素定位在腫瘤細胞和正常細胞的細胞核，無明顯的凋亡形態特征變化。轉染48 小時后，凋亡素從正常細胞核內出來在胞質中聚集，無凋亡形態特征變化；而仍定位于腫瘤細胞的核內，聚集，可以見到細胞核的染色質高度凝聚，細胞核裂解為碎塊，邊緣不清晰，產生凋亡小體，引起腫瘤細胞的特異凋亡。
3.2 雙向電泳結果我們通過雙向電泳進行初步分析，發現HepG2 與L02 細胞核蛋白表達存在差異。
4．討論
凋亡素能夠特異引起腫瘤細胞與轉化細胞的凋亡，這種細胞凋亡是非P53 依賴的，而不能夠導致正常細胞的凋亡。同時我們觀察到，凋亡素在細胞內的定位與其凋亡功能密切相關。將凋亡素的基因轉染進細胞，24 小時后，我們發現凋亡素無論在腫瘤細胞還是正常細胞，都定位在細胞核內，都不引起細胞的凋亡。48 小時后，凋亡素在腫瘤細胞核內聚集，行使凋亡功能，而凋亡素卻從正常細胞的核內出來，在胞質內聚集，不能引起正常細胞的凋亡。于是我們推測，凋亡素行使凋亡功能與其在腫瘤細胞核內受到某種修飾，而停留在細胞核內有關。而這種修飾在正常細胞的核內是沒有的，因此腫瘤細胞與正常細胞之間一定存在著某種蛋白表達的差異。
凋亡素包含兩個分開的核定位信號（位置82-88，111-121），和一個CRM1 調節的核輸出信號。有文獻報道，當凋亡素進入腫瘤細胞核內后，其108 位的蘇氨酸被磷酸化，抑制了CRM1 的活性，影響了凋亡素在腫瘤細胞內的核輸出。而凋亡素在正常細胞內不被磷酸化，核輸出信號依賴CRM1 使凋亡素從核內輸出，在胞質內聚集成大的聚合體，而最終被其他蛋白所中和，喪失了誘導細胞凋亡的功能。
因此，我們可以推測在腫瘤細胞內存在著特異的磷酸激酶，或者其他某種能使凋亡素特異修飾的蛋白。
目前高通量的蛋白質組學研究方法已經成為了有力的手段，蛋白質質譜鑒定技術和生物信息學迅猛發展。高分辨率、高敏感性和高流通性的分離和分離后鑒定技術，結合準確、全面的數據庫技術，使蛋白質組技術用于生物研究卓有成效。我們通過蛋白質組學的方法找到了腫瘤細胞HepG2 細胞和正常細胞L02 細胞核蛋白表達的差異，但是由于時間關系，沒有對差異點進行質譜分析，鑒定，這是我們下一步的工作，以期望能夠找到這個特異的蛋白，來完善凋亡素的機制研究。
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