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腺病毒介導凋亡素基因對人膽管癌細胞凋亡的研究
畢業論文【摘要】 目的 探討凋亡素基因轉染對人膽管癌細胞凋亡的影響，為膽管癌的治療探索新方法。方法 采用含凋亡素基因的重組腺病毒感染膽管癌細胞株QBC939，在確定其感染復數后通過光鏡、熒光觀察其凋亡情況，同時通過TUNEL染色統計凋亡率。結果 膽管癌細胞株QBC939的重組腺病毒的感染復數為65，在感染后第3天凋亡素基因能引發膽管癌細胞株QBC939的凋亡，并且隨著時間的推移其作用越明顯，在第7天凋亡率達到61.9%。結論 凋亡素能明顯引發人膽管癌細胞的凋亡，在膽管癌的治療上具有較大潛力。
【關鍵詞】 凋亡素基因； 腺病毒載體； 基因治療； 膽管癌
【Abstract】 Objective To study the effect of adenovirus?mediated apoptin gene on apoptosis of human bile duct carcinoma cells and explore new ways to manage bile duct carcinoma. Methods The human bile duct carcinoma cell line QBC939 was transfected by recombinant adenovirus carrying apoptin gene. After the multiplicity of infection was determined successfully, the apoptosis of human bile duct carcinoma cell line QBC939 was observed by light microscopy and fluorescence microscopy and the rate of apoptosis detected by TUNEL stain. Results The value of multiplicity of infection of human bile duct carcinoma cell line QBC939 transfected by recombinant adenovirus was 65. Apoptin gene started to induce the apoptosis of human bile duct carcinoma cell line QBC939 on the 3rd day and the induction function of apoptin gene increased with time. The apoptosis index of human bile duct carcinoma cell line QBC939 reached 61.9% on the 7th day. Conclusion The apoptin gene can obviously induce the apoptosis of human bile duct carcinoma cell line QBC939, and may be a powerful tool to treat cholangiocarcinoma.
【Key words】 Apoptin gene; Adenovirus vector; Gene therapy; Cholangiocarcinoma
凋亡素， 又稱Apoptin(apoptosis induction)，是來源于雞貧血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子蛋白質。它能引發1些腫瘤細胞和轉化細胞的凋亡，而對正常細胞無此作用。這提示凋亡素在腫瘤的治療上具有較大潛力［1］。目前膽管癌的治療效果難盡人意，迫切需要探索新的治療方法。本實驗利用腺病毒為載體轉染人膽管癌細胞株，以觀察凋亡素基因對人膽管癌細胞凋亡的影響程度，以期探索治療膽管癌的新方法。
1 材料與方法
1.1 材料
我們已成功構建含凋亡素基因的重組腺病毒載體［2］。不含目的基因的腺病毒載體由第3軍醫大學西南醫院燒傷研究所賀偉峰提供；人膽管癌細胞株QBC939由本研究所王曙光建株［3］；Cytospin 3型細胞離心機購自美國Shandon公司；TUNEL試劑購自德國Roche公司。
1.2 方法
1.2.1 QBC939細胞的重組腺病毒感染復數(multiplicity of infection,MOI)的測定：在6孔板上傳5×105/孔培養QBC939細胞，細胞過夜生長。將病毒量為6.56×109 pfu/ml的病毒稀釋5倍后分別取2、5、10、25、50 μl(相應的病毒量為：2.61×106、6.56×106、1.31×107、3.28×107、6.56×107)加入6孔板中的5孔，第6孔作為對照。同時加培養液500 μl，5% CO2、37 ℃條件下孵育。間隔30 min輕輕搖晃數次，使之與細胞充分接觸，孵育3 h后加入培養液1500 μl，72 h后用熒光顯微鏡觀察細胞的熒光情況。選取接近100%的細胞發熒光的孔所對應的病毒量來計算MOI值。公式為MOI=病毒數/細胞數。這樣可確定最佳感染復數。
1.2.2 重組腺病毒對膽管癌細胞株QBC939的感染： 根據上1步探索出的最適MOI來決定病毒的量， 每日通過熒光顯微鏡觀察并記錄QBC939細胞的情況。在1、3、5、7 d后分別收集細胞爬片， 對于脫落的細胞采用制成細胞甩片來觀察。實驗共分3組， 重組腺病毒組、 空病毒組和空白組(培養液組)。甩片的制作為： 100×g離心10 min， 用PBS洗滌細胞1次， 然后用4 ml PBS重溶細胞， 記錄收集的細胞數目約為4000個。將1/10的液體加入與甩片裝置安裝好的玻片上， 1000×g離心10 min后制成細胞甩片。
1.2.3 人膽管癌細胞爬片及甩片的TUNEL染色：人膽管癌細胞爬片和甩片的TUNEL染色嚴格按照試劑盒說明書進行。同時計算凋亡率。公式為：凋亡率(Apoptosis Index,AI)=陽性細胞數/500細胞總數×100%。
1.3 統計學分析
SPSS 10.0統計軟件對數據進行分析，各組間分別進行獨立樣本t檢驗檢測均值， 結果用±s表示。
2 結果
2.1 膽管癌細胞株QBC939的最適腺病毒MOI值
我們用不同腺病毒濃度對應MOI分別為5.3、13.1、26.2、65和131。隨著MOI的提高，膽管癌細胞株的感染率也相應提高，但同時也出現了細胞脫壁現象的增加。這提示腺病毒的毒性作用也隨之增大。所以最適MOI應該是細胞的感染率較高，同時細胞脫落和其對應的毒性作用相對較低。因此我們確定MOI為65是含凋亡素基因腺病毒的最適感染復數值(圖1)。同時MOI為65所對應的空病毒感染也提示感染率很高，細胞脫落現象較少。所以我們也將此值作為空病毒的最適感染復數值。
A：重組腺病毒組光鏡圖； B：重組腺病毒組熒光圖； C：空病毒組光鏡圖； D：空病毒組熒光圖
圖1 膽管癌細胞株QBC939的最適腺病毒為65的光鏡和熒光觀察結果 (×400)
2.2 重組腺病毒感染QBC939細胞后的變化
我們從膽管癌細胞株QBC939的光鏡和熒光照片觀察到如下現象：(1)光鏡下，細胞在感染含凋亡素基因的病毒后第1天可觀察到有少量細胞脫落，同時細胞開始出現感染病毒后的變化：細胞略腫脹，有少量細胞融合，但細胞排列結構沒有變化，隨著感染時間延長，細胞脫落數增加，細胞開始變小，細胞核和細胞質縮小，細胞巢狀生長的密度明顯降低。少數細胞可明顯觀察到核仁沿核膜排列呈新月狀。在感染后第7天可觀察到細胞核變成兩個核，細胞變小，有些細胞已經失去正常結構成為碎片樣�？詹《窘M和空白對照組以上變化不明顯，反而是細胞密度增加，細胞脫落數目較含凋亡素基因的腺病毒明顯減少。(2)熒光下，第4天觀察到大部分細胞發出熒光。 這說明在第4天腺病毒的感染才達到高峰。這時，含凋亡素基因腺病毒感染的細胞脫落量較空病毒組和空白對照組大，并且脫落的細胞也呈現熒光，有些細胞輪廓明顯變小，熒光強度明顯增加，也有1些細胞結構消失，變為散狀的熒光碎片，而空病毒組以上變化不明顯(圖2)。
2.3 腺病毒感染后QBC939細胞的TUNEL染色及統計結果
我們的實驗中膽管癌細胞含有熒光蛋白，所以采用復染后封片觀察。其陽性結果是細胞核染成棕色，而非凋亡細胞則為藍色。從圖3可看出，含凋亡素基因的腺病毒感染膽管癌細胞后出現細胞核的棕色染色較空病毒組和空白對照組明顯增多。
從圖4可看出， 隨著時間的推移， 含凋亡素基因腺病毒感染QBC939細胞的凋亡率是逐漸增高。從第3天開始， 含凋亡素基因的腺病毒組的凋亡率較其他兩組明顯增高。隨著時間的延長， 差異越來越明顯。這充分說明凋亡素基因能引發膽管癌細胞株QBC939的凋亡。含凋亡素基因的腺病毒組的凋亡率在第7天可達61.9%， 而空病毒感染的QBC939細胞的凋亡率為10.91%， 正常QBC939細胞的凋亡率為6.89%。顯示正常的膽管癌細胞是存在凋亡的， 但凋亡率較低。含凋亡素基因的腺病毒引發QBC939細胞的凋亡較空病毒組和空白對照組明顯增高， 表明凋亡素能引發膽管癌QBC939細胞的凋亡。
A：重組腺病毒組光鏡圖； B：重組腺病毒組熒光圖； C：空病毒組光鏡圖； D：空病毒組熒光圖
圖2 腺病毒感染QBC939細胞后7 d的光鏡和熒光觀察結果 (×400)
A：重組腺病毒組爬片結果； B：重組腺病毒組甩片結果； C：空病毒組爬片結果；
D：空病毒組甩片結果； E：空白對照組爬片結果； F：空白對照組甩片結果
圖3 腺病毒感染QBC939細胞后7 d的染色結果 (TUNEL ×400)
圖4 腺病毒感染QBC939細胞后的凋亡率折線圖
3 討論
正常膽管上皮細胞的更新和凋亡是維持動態平衡的。當其受損， 必然會引發癌基因和抑癌基因的
突變， 特別是凋亡相關基因的突變， 使本該凋亡的缺陷細胞得以生存， 并不斷增殖而可能形成腫瘤。所以膽管癌的發生、 發展也是機體引發凋亡失敗的結果。當膽管癌形成后由于局部缺血、 基質反應失控和內在凋亡機制的激活會出現自發的凋亡現象［4］。張豐深等［5］發現膽管癌臨床標本的自發凋亡率約為7.89%， 而且低分化和具有轉移潛能的膽管癌細胞的自發凋亡率較低。由此判斷自發凋亡率低的膽管癌細胞可能具有更多的逃避凋亡的機制， 因此， 誘發轉化的膽管上皮細胞和膽管癌細胞的凋亡在預防和治療膽管癌以及抑制其轉移都具有重要意義。
凋亡素是外來蛋白，對多數轉化細胞和腫瘤細胞具有促凋亡作用，而對正常細胞無凋亡效應和毒副作用。故其在腫瘤的治療上有廣闊的前景［6］。而膽管癌由于本身特殊的生物學行為，在臨床上明確診斷后往往屬于中晚期，手術切除率低，復發率高，臨床療效難盡人意。所以人們開始探索新的治療方法，特別是基因治療，希望能極大提高它的療效［7］。因此我們運用基因工程技術構建了含凋亡素基因的腺病毒并轉染膽管癌細胞株QBC939，考慮到在脫落細胞中也存在凋亡細胞，為準確統計凋亡率，我們將脫落細胞制成甩片進行染色，以便更全面的了解凋亡素基因對膽管癌細胞的作用。結果發現凋亡素基因能引發膽管癌細胞株QBC939的凋亡，凋亡率可達到61.9%，與Noteborn［8］在其他腫瘤的研究結果相似。但凋亡率較他們的結果相對偏低，可能有如下原因：(1)腫瘤細胞凋亡的異質性。由于腫瘤細胞本身的遺傳背景使凋亡素引發不同腫瘤細胞的凋亡率是不會相同的。(2)雖然腺病毒的感染率很高，仍會有少量的細胞不被感染，而膽管癌細胞的生長速度很快，加之凋亡素最高效應的發揮是在第5天左右，因此我們得到的結果偏低，但也明顯高于空病毒感染的膽管癌細胞和其自發的凋亡。本研究提示凋亡素能明顯抑制膽管癌細胞的生長，在膽管癌的治療上具有較大的潛力。
【參考文獻】
［1］ Maddika S, Mendoza F, Hauff K, et al. Cancer-selective therapy of the future: apoptin and its mechanism of action. Cancer Biol Ther,2006,5(1):10-19.
［2］ 陳健，李大江，王曙光.凋亡素基因重組腺病毒的構建.消化外科，2006，5(4)：269-273.
［3］ 王曙光，韓本立，段恒春，等.肝外膽管癌細胞系的建立.中華實驗外科雜志，1997，14(2)：67-68.
［4］ Ishimura N, Isomoto H, Bronk SF, et al. Trail induces cell migration and invasion in apoptosis-resistant cholangiocarcinoma cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2006,290(1):129-165.
［5］ 張豐深，何振平，馬寬生，等.膽管癌組織中自發細胞凋亡現象的研究.中國腫瘤臨床，2000，29(6)：381-383.
［6］ Heilman DW, Green MR, Teodoro JG. The anaphase promoting complex: a critical target for viral proteins and anti?cancer drugs. Cell Cycle,2005,4(4):560-563.
［7］ Meng F, Henson R, Lang M, et al. Involvement of human micro?RNA in growth and response to chemotherapy in cholangiocarcinoma cell lines. Gastroenterology,2006,130(7):2113-2129.
［8］ Noteborn MH. Apoptin acts as a tumor?specific killer: potentials for an anti?tumor therapy. Cell Mol Biol,2005,51(1):49-60.
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