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擬Smac作用下膀胱癌T24 細胞增殖及凋亡的研究
引言
Smac/DIABLO 蛋白（線粒體促凋亡蛋白）自被發現以來，經過幾年的研究已經成為細胞凋亡研究中的一個熱點。近年來，國內外很多學者將其應用于泌尿系統腫瘤研究和治療，并認為Smac/DIABLO及由它衍生而來的小分子多肽及其類似物將為未來泌尿系統腫瘤的治療開辟一個新領域[1]。納米技術作為近年來出現的高技術新興科學，由于其表現出現的各種特性，有利于醫學及其各個分支的研究，特別是對腫瘤的早期診斷和治療有著顯著的意義。
本文將二者相互聯系，通過合成的擬Smac 多肽磁性納米粒作用于膀胱癌T24 細胞，探討其對膀胱癌T24 細胞的增殖及凋亡的影響2. 材料與方法2.1 試劑擬 Smac 合成肽羧甲基殼聚糖磁性納米復合物（SmacN7-O-CMC-MNPS）由前期實驗制備合成。MTT 溶液、Hoechst33258 染色試劑盒購自武漢凌飛生物公司。抗Bcl-2、Bax、β-actin單克隆抗體購自美國cellsignal 公司。RPMI1640 培養基及胎牛血清購自美國GIBCO 公司。
其他常用生化試劑購自美國Sigma 公司。
2.2 細胞培養與實驗分組實驗
設正常對照組（A）、單純SmacN7-O-CMC-MNPS 組（B）和SmacN7-O-CMC-MNPS加磁場組（C）。膀胱癌T24 細胞用含10%的胎牛血清的RPMI1640 培養基培養于5%CO2的37℃培養箱中，待細胞生長至對數期時用無血清1640 洗滌2 次，每孔滴加0.5μmol/L 的SmacN7-O-CMC-MNPS，C 組磁場為8mT。轉染4h 后加入含胎牛血清的1640 培養基繼續培養。
2.3 MTT 檢測細胞增殖參照 MTT 試劑盒使用說明。
以細胞密度約104/孔接種于96 孔板，按照上述實驗分組，每組設置4 個復孔，每孔100ul，按照不同分組加入藥物，繼續培養24h、48h、72h 后采用MTT 法檢測細胞增殖活性，繪制細胞增殖率變化曲線，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖率=實驗組A490nm/正常對照組A490nm×100%，（A 為吸光度值）細胞增殖抑制率=（1-細胞增殖率）×100%。
2.4 Hoechst33258 檢測細胞凋亡將各實驗組
按照上述實驗方法處理24h 后，用0.25%胰酶+0.02%的EDTA 消化細胞，制備單細胞懸液，調整細胞濃度約為107 /ml,取細胞懸液100ul，加5ul Hoechst33258 染液（100ug/ml）細胞懸液中，充分混勻后滴于載玻片上，蓋片封片后在熒光顯微鏡下觀察細胞形態并攝影。
2.5 實時熒光定量PCR（Realtime RT-PCR）檢測
P53,Bax,Bcl-2 mRNA 的表達采用 TRIZOL 試劑兩步法提取各實驗組細胞的總RNA，運用逆轉綠試劑盒合成cDNA.使用primer5.0 設計Bax、Bcl-2、β-actin 引物。反應體系20ul：cDNA 0.8ul、上游引物0.8 ul、下游引物0.8ul、SYBR Green Mix 10ul、DEPC H2O 7.6ul.擴增條件：94℃ 預變性5min，94℃ 30S， x℃(不同基因退火溫度不同)15S, 72℃15S,共計40 個循環，72°延伸10min，每0.2℃讀板一次，繪制擴增曲線及溶解曲線，收集數據。
2.6 蛋白免疫印跡（Western-Blot）檢測
Bax,Bcl-2 蛋白的表達收集各實驗組細胞，用BCA 試劑盒對蛋白樣品定量。取等量蛋白20ug 上樣于10%的SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠），以120mV 恒壓電泳1h，200mA 恒流轉膜50min，膜于含5%脫脂奶粉的TBST20ml 封閉液室溫封閉30min，加一抗(1:1000)4℃過夜，次日TBST 洗膜10min×3 次，加用封閉液稀釋的HRP 標記的二抗（1：7500）室溫1h，TBST 洗膜10min×3次，加ECL 發光，X 膠片曝光，洗片，收集數據。
2.7 統計學分析所有數據
均以x ± s表示，采用SPSS15.0統計軟件處理，不同處理組間差異采用ANOVA或 Dunnett T-test，P<0.05 為差異有統計學意義。
3. 結果3.1 SmacN7-O-CMC-MNPS 聯合磁場
能顯著抑制膀胱癌T24 細胞增殖及誘導凋亡和對照組相比，SmacN7-O-CMC-MNPS轉染膀胱癌T24 細胞后和SmacN7-O-CMC-MNPS加磁場組均不同程度地出現腫瘤細胞生長抑制和凋亡；而SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒外加磁場對T24 細胞的生長抑制作用和誘導凋亡作用更明顯。
3.2 SmacN7-O-CMC-MNPS
聯合磁場對膀胱癌T24 細胞凋亡相關基因的mRNA及蛋白表達的影響在外磁場條件下，SmacN7-O-CMC-MNPS 轉染膀胱癌T24 細胞24h、48h、72h 后采用Realtime RT-PCR 及Western blot 檢測，結果可見Bcl-2 的mRNA 和蛋白的表達隨著作用時間的延長而逐漸降低。相反，Bax 的表達量則逐漸升高，且此效應比不加磁場的SmacN7-O-CMC-MNPS 轉染膀胱癌T24 細胞的作用更明顯，這說明外磁場條件下SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒能透過膀胱癌T24 細胞細胞膜，通過干擾凋亡信號傳導通路誘導細胞的凋亡。
4. 討論Smac/DIABLO 在胞漿中合成最初的前體蛋白
含239 個氨基酸，分子量為27KD，SmacmRNA 全長1.5Kb。全長的Smac/DIABLO 蛋白沒有任何活性，必須在線粒體內進行信號肽的切除后才能獲得促凋亡生物活性。Smac/DIABLO 參與細胞凋亡的死亡受體通路和線粒體通路的下游反應，通過競爭性地結合凋亡抑制蛋白IAPs 解除對caspase 的阻遏而促進凋亡的發生。Smac/DIABLO 蛋白衍生的含AVPI 四肽結構的小分子多肽也具有重要的抗腫瘤效果。研究表明，Smac/DIABLO 小肽與載體蛋白結合并轉染細胞后可以使體內和體外化療藥物誘導的腫瘤細胞凋亡效果明顯增加。Smac/DIABLO 蛋白通過干擾凋亡信號轉導通路，促進腫瘤細胞凋亡，抑制其過度增殖。
多肽合成技術的突破性進步，使多肽類藥物顯示出優于傳統藥物的治療效果，但由于其具有難以透過生物膜屏障且不穩定、易降解變性等特點限制了它的臨床應用。如果將靶向藥物進行適當修飾就可能起到保護藥物，提高藥物的穩定性，促進藥物的吸收利用，進而產生良好的生物學效果。磁性納米顆粒可以作為多肽、激素、單克隆抗體、基因等物質的載體，也可以攜帶藥物；同時它具有超順磁特性，即在磁場中有較強的磁性，沒有磁場時磁性很快會消失，從而不會被永久磁化；而且納米級Fe3O4 能夠排出體外，在外加磁場的作用下可以使得其作為載體復合物所攜帶的藥物作定向移動，從而實現靶向治療。
Smac 是一種新型的線粒體促凋亡蛋白，其N 端的AVPI 四肽發揮著重要的促凋亡作用。本實驗通過合成擬Smac 多肽羧甲基殼聚糖磁性納米復合物，在外加磁場下作用于膀胱癌T24 細胞，實驗數據顯示，外加磁場的誘導下SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒能發揮擬Smac 合成肽的抑制腫瘤細胞增殖及促凋亡作用，且外加磁場作用更為明顯。而且，SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒是通過調控凋亡相關基因Bcl-2，Bax 來影響腫瘤細胞的活性。
綜上，本實驗首次將人工合成促凋亡多肽制成磁性納米顆粒SmacN7-O-CMC-MNPS 在外加磁場下作用于膀胱癌細胞，顯著抑制了腫瘤細胞的增殖并誘導細胞凋亡，為膀胱腫瘤的體內磁導向靶向治療提供了有力的實驗保障。
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