乙醇對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞脂肪酸氧化速度的影響

乙醇對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞脂肪酸氧化速度的影響

乙醇對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞脂肪酸氧化速度的影響 【摘要】 目的 建立小鼠肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，同時(shí)檢測(cè)乙醇對(duì)肝細(xì)胞脂肪酸β-氧化速度的影響。方法 采用戊巴比妥麻醉小鼠，通過肝臟灌注和膠原酶消化分離小鼠肝細(xì)胞，接種于膠原包被的培養(yǎng)皿中進(jìn)行體外培養(yǎng)。通過HE染色觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。在20mmol/L乙醇存在的情況下，通過3H標(biāo)記的棕櫚酸（C16:0）檢測(cè)肝細(xì)胞的脂肪酸氧化速度。結(jié)果 成功地分離了肝細(xì)胞，肝細(xì)胞的存活率≥95%。肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)48h仍能夠保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。對(duì)肝細(xì)胞脂肪酸氧化速度的研究發(fā)現(xiàn)，20mmol/L酒精能夠?qū)е赂渭?xì)胞的脂肪酸氧化速度降低40%左右，導(dǎo)致肝細(xì)胞中脂肪含量增加。結(jié)論 本研究成功地建立肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，采用3H標(biāo)記的脂肪酸能夠敏感地檢測(cè)脂肪酸氧化速度，而研究發(fā)現(xiàn)乙醇能夠抑制肝細(xì)胞脂肪酸氧化速度。同時(shí)，本研究結(jié)果為肝細(xì)胞的脂肪和糖類代謝的研究提供了實(shí)驗(yàn)條件。

【關(guān)鍵詞】 乙醇；肝細(xì)胞；脂肪酸

The effect of ethanol on fatty acid oxidation of mice primary hepatocytes


【Abstract】 Objective To isolate the mice primary hepatocytes，and the cells were cultured in vitro.The influence of ethanol on fatty acid β-oxidation velocity was measured.Methods The mouse was anesthetized with pentobarbital，and the liver was degested with collagenase.The primary hepatocytes were inoculated in collagen-coated dishes.The morphology of cultured primary hepatocytes was observed by HE staining.The fatty acid β-oxidation was measured using ［9，10-3H］ palmitic acid (C16:0) as a tracer.Results The primary hepatocytes were isolated and cultured successfully，and the viability was more than 95%.20mmol/L ethanol could reduce the speed of fatty acid β-oxidation about 40%，and lead to the increased lipid level in hepatocytes.Conclusion We isolated and cultured the mouse primary hepatocytes in vitro，and the influence of ethanol on fatty acid β-oxidation was determined.This study is helpful for the research on the lipid metabolism in liver.

【Key words】 ethanol;hepatocyte;fatty acid

肝臟在脂肪、糖和蛋白質(zhì)的代謝過程中具有重要的作用。在體內(nèi)肝細(xì)胞的代謝受到各種因素的影響。酒精在人肝細(xì)胞中主要由乙醇脫氫酶和過氧化氫酶代謝成具有細(xì)胞毒性的乙醛，然后由乙醛脫氫酶代謝為乙酸。在這個(gè)過程中，肝臟的糖脂代謝將受到影響。本研究通過體外分離肝細(xì)胞和培養(yǎng)，研究乙醇對(duì)肝細(xì)胞的脂肪酸氧化速度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6小鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；戊巴比妥鈉、膠原酶、胰島素、異丙腎上腺素，棕櫚酸為Sigma公司；［9，10-3H］Palmitic acid為Amersham Bioscience產(chǎn)品；Hisafe 3閃爍計(jì)數(shù)液為PE公司產(chǎn)品。

1.2 肝細(xì)胞的分離 取C57BL/6小鼠，采用戊巴比妥鈉（100mg/kg）麻醉；打開小鼠腹腔，向左側(cè)移開小腸，暴露下腔靜脈和門靜脈，使用3號(hào)絲線從腎靜脈近端繞過下腔靜脈；采用21號(hào)套管針從下腔靜脈傳入，直至接近肝靜脈；用絲線固定套管針，采用含有1mM EGTA和0.1%葡萄糖的Kreb-Ringer緩沖液灌注肝臟，同時(shí)迅速切斷門靜脈使灌注液從門靜脈流出，灌注壓力為20cm水柱，灌注速度為4ml/min；灌注20ml后更換含有0.5mg/ml膠原酶和5mM CaCl2的灌注液繼續(xù)灌注10min，立刻小心取出肝臟，置于含有Kreb-Ringer緩沖液的10mM培養(yǎng)皿中，用剪刀剪開肝臟包膜，輕輕晃動(dòng)使肝細(xì)胞釋放出來；采用70μm的細(xì)胞濾器過濾；使用10鸖的DMEM洗滌細(xì)胞2次，50×g離心。

1.3 存活性鑒定 分離后的肝細(xì)胞立刻用4%臺(tái)盼藍(lán)染色，在顯微鏡下觀察，核呈藍(lán)色為死細(xì)胞，拒染的細(xì)胞為活細(xì)胞，將細(xì)胞接種于膠原包被的12孔培養(yǎng)皿中，采用含有10%胎牛血清，100u/ml青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在5%CO2，37°C培養(yǎng)。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察 （1）脂肪染色：取不同培養(yǎng)時(shí)間的肝細(xì)胞，4%多聚醛溶液固定，油紅O（Oil Red O）染色，再用蘇木精襯染細(xì)胞核，緩沖甘油封片后，觀察肝細(xì)胞中脂肪的含量。（2）蘇木精-伊紅（HE）染色：固定的肝細(xì)胞用蘇木精-伊紅染色，脫水透明后，觀察不同生長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5 脂肪酸氧化速度 肝細(xì)胞脂肪酸氧化速度根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行［1］，將分離的肝細(xì)胞接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2 ×105/孔，細(xì)胞貼壁12h后開始測(cè)定肝細(xì)胞脂肪酸的氧化速度。先用PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入500μl含有0.5mg/ml BSA，22μM ［9，10(n)-3H］棕櫚酸 (1μCi/孔)的Hanks液，試驗(yàn)孔中同時(shí)加入20mM乙醇，每組3個(gè)復(fù)孔。37°C培養(yǎng)2h后將培養(yǎng)液立即轉(zhuǎn)移到玻璃試管中，并采用0.5ml Hanks液洗滌細(xì)胞2次，將洗滌液也加入玻璃試管中。采用Folch法抽提脂肪酸，每管中加入8ml 甲醇/氯仿(2:1)和0.5ml 2 M KCl/2 M HCl溶液。劇烈混合30min后離心，將上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的玻璃試管中，繼續(xù)采用甲醇/氯仿抽提一次，將水相轉(zhuǎn)移到閃爍瓶中，加入10ml閃爍液，混合后采用閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定脂肪酸氧化后生成的3H2O量。肝細(xì)胞的蛋白含量采用Brad-ford法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 分離肝細(xì)胞存活率 肝細(xì)胞分離的存活率，大于95%。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 分離的肝細(xì)胞，在培養(yǎng)12h后即能夠充分貼壁生長(zhǎng)。肝細(xì)胞在生長(zhǎng)的早期（24～48h）細(xì)胞狀態(tài)較好，可見明顯細(xì)胞極性，細(xì)胞排列生長(zhǎng)（圖1A）。細(xì)胞生長(zhǎng)后期（

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