尿毒癥患者血清對(duì)小鼠骨髓紅系祖細(xì)胞集落形成影響的研究

尿毒癥患者血清對(duì)小鼠骨髓紅系祖細(xì)胞集落形成影響的研究

作者：孫倩美 劉敬偉 陳向東
【關(guān)鍵詞】 尿毒癥
　　【摘要】 目的 本文采用甲基纖維素細(xì)胞培養(yǎng)的方法，分析尿毒癥患者血清對(duì)小鼠骨髓紅系祖細(xì)胞集落形成的影響，初步探討紅細(xì)胞生成抑制因子的存在。方法 選擇12例尿毒癥腎性貧血未透析患者為試驗(yàn)組，另選正常健康體檢者12例為正常對(duì)照組，將實(shí)驗(yàn)組、正常對(duì)照組血清分別稀釋成不同終濃度，采用甲基纖維素細(xì)胞培養(yǎng)的方法對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)比不同濃度血清組紅系集落形成單位（CFU-E）、紅系爆式形成單位（BFU-E）的集落數(shù)。結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)組中，與血清濃度為0的濃度組相比，與各濃度組血清共同培養(yǎng)的小鼠骨髓CFU-E和BFU-E的集落數(shù)均明顯減少，且隨血清濃度的增加，小鼠骨髓CFU-E和BFU-E的集落數(shù)逐漸減少，各濃度組間差異有顯著性（P＜0.05）。結(jié)論 尿毒癥患者血清抑制小鼠骨髓紅系祖細(xì)胞集落形成，隨患者血清濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，具有劑量依賴性。
　　【關(guān)鍵詞】 尿毒癥；貧血；紅系祖細(xì)胞；集落形成單位測(cè)定
　　【Abstract】 Objective To investigate the existence of the erythropoiesis inhibitors （EI）.Methods The present study included twelve undialyzed ESRD patients with anemia.The sera from the uremic patients were added to CFU-E and BFU-E culture in the concentrations ranging from 1.25% to 5%.In vitro CFU-E and BFU-E growth in the presence of sera from ESRD patients was compared with in the presence normal human subjects with the use of normal mice bone marrows.Results The effects of the sera from uremic patients on CFU-E and BFU-E colony growth in concentrations ranging from 1.25% to 5% were investigated to be dose-dependent.The effect increased with the concentrations increasing of the sera（P＜0.05）.There were not significant inhibitory effect on the CFU-E and BFU-E growth of mice bone marrow in vitro from sera of the normal subjects.Conclusion The erythropoiesis inhibitors exist in uremic sera which has a dose-dependent inhibitive effects on the growth CFU-E and BFU-E of normal mice bone marrow cells.
　　【Key words】 uremia;anemia;erythroid progenitor cell;colony-forming units assay
　　貧血是尿毒癥常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和疾病的預(yù)后。紅細(xì)胞生成素（EPO）缺乏是尿毒癥貧血的主要原因，但應(yīng)用人基因重組紅細(xì)胞生成素（rHu-EPO）治療仍有20%~30%左右的患者療效不佳［1］。目前的研究顯示，一些尿毒癥患者血EPO濃度并不下降，而是正常甚至高于正常，提示尚有其他重要因子參與腎性貧血的機(jī)制［2，3］。有研究表明，尿毒癥患者血清能抑制骨髓紅系祖細(xì)胞生長(zhǎng)，充分透析增加毒素的消除，可改善尿毒癥的貧血、提高rHu-EPO的療效，所以提出了尿毒癥某些毒素可能是紅細(xì)胞生成抑制因子。但不同的研究小組獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也存在爭(zhēng)議。因此，近年來(lái)有關(guān)尿毒癥紅細(xì)胞生成抑制因子是否存在又引起學(xué)者們的關(guān)注，但目前仍沒(méi)有達(dá)成共識(shí)。本文通過(guò)觀察尿毒癥患者血清對(duì)小鼠骨髓紅系祖細(xì)胞集落形成的影響，初步探討紅細(xì)胞生成抑制因子是否存在。
　　1 對(duì)象與方法
　　1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 選擇12例尿毒癥腎性貧血未透析患者為實(shí)驗(yàn)組，原發(fā)病為慢性腎炎8例、高血壓腎動(dòng)脈硬化2例、慢性腎盂腎炎2例，其中男5例，女7例�；颊咂骄�年齡（50±12）歲，Cr范圍8.2~14.7mg/dl，BUN范圍83~135mg/dl。入選病例均無(wú)慢性炎癥（C-反應(yīng)蛋白水平正常），無(wú)血液系統(tǒng)疾病或腫瘤，無(wú)鐵缺乏（血清鐵蛋白＞100ng/ml）�；颊咴趯�(shí)驗(yàn)前均無(wú)輸血史，未使用過(guò)rHu-EPO、鐵劑，實(shí)驗(yàn)前一個(gè)月未使用過(guò)ACEI。另選正常健康體檢者12例設(shè)為對(duì)照組，男6例，女6例，平均年齡（48±14）歲。
　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法
　　1.2.1 標(biāo)本采集與保存 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組受試者均于清晨空腹抽取靜脈血，室溫靜置30min后離心，分離血清，56℃加熱滅活30min，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?BR>　　1.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞紅系集落形成單位（CFU-E）、紅系爆式形成單位（BFU-E）的培養(yǎng) 取8~10周Bal-c小鼠（均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供）。小鼠擊頭處死，75%酒精浸泡20min。立即無(wú)菌取出雙側(cè)骨髓，用IMDM培養(yǎng)液沖出全部骨髓細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用IMDM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/0.2ml（活細(xì)胞率＞95%）。
　　1.2.3 培養(yǎng)體系和條件 2.7%甲基纖維素，IMDM培養(yǎng)液，10-4mol/L巰基乙醇，15%小牛血清，3%谷氨酰胺，EPO（2u/0.2ml），CSF（50ng/ml），IL-3（10ng/ml）。將混勻的體系分別加到兩個(gè)30mm培養(yǎng)皿中，加蓋后放入37℃、飽和濕度的5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)第3天，聯(lián)苯胺染色后倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)含8個(gè)以上染色陽(yáng)性的細(xì)胞集落為CFU-E。培養(yǎng)第7天，計(jì)數(shù)含50個(gè)以上染色陽(yáng)性的細(xì)胞集落為BFU-E。
　　1.2.4 實(shí)驗(yàn)方法 將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組血清分別用IMDM培養(yǎng)液稀釋成終濃度為0（用等量培養(yǎng)液代替血清，作為陰性對(duì)照）、1.25%、2.5%、5.0%，觀察兩組不同濃度血清對(duì)小鼠骨髓CFU-E、BFU-E集落生長(zhǎng)的影響。
　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±

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