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淺論花色苷基因工程改良及其策略
摘要： 基因工程在植物花色改良中正發(fā)揮著越來越來重要的作用，綜述了植物花色苷基因工程所采用的方法和策略，包括花色苷生物合成基因的分離克隆、基因的遺傳轉(zhuǎn)化和基因工程改良的基本策略。關(guān)鍵詞： 花色；基因工程；花色苷；植物色素
利用基因工程改良花色是花卉分子育種的重要手段，不再受植物親緣關(guān)系的限制，花色改良的效果通過目測和少量輔助手段即可判斷[1]。花色苷是植物次生代謝過程中產(chǎn)生的黃酮類物質(zhì)，它是花色素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物，廣泛存在于植物各組織細(xì)胞的細(xì)胞液中，使植物呈現(xiàn)從紅、紫到藍(lán)等的不同顏色[2]�；ㄉ盏纳锖铣赏緩绞潜蛔顬閺V泛而深入研究的植物次生代謝途徑，特別在主要模式植物中，已經(jīng)有了清楚的認(rèn)識[3]。許多花色苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因和調(diào)節(jié)基因均已經(jīng)從不同植物中克隆到[3，4]。轉(zhuǎn)基因花卉主要用于觀賞，易被公眾接受，具有傳統(tǒng)育種手段難以比擬的優(yōu)越性，必將給花色改良帶來革命性的影響，已成為當(dāng)前花卉育種研究的熱點。
1 花色苷生物合成基因的分離和克隆
植物花色苷基因工程改良遵循一般植物基因工程規(guī)律，了解特定色素生物合成途徑、克隆關(guān)鍵酶的基因是植物花色基因工程改良理論依據(jù)和前提。首先是花色苷生物合成途徑基因的克隆，第1個被分離的花色苷合成酶基因是CHS基因，它是從歐芹（Petroselinum cnispum）懸浮細(xì)胞用差異雜交分離到的[5]；以后利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽、PCR擴(kuò)增、異源雜交、差異cDNA克隆、電子克隆、蛋白質(zhì)純化與差異篩選等方法分離克隆到了多個花色苷生物合成相關(guān)基因�；ㄉ盏纳锖铣墒菑拿Р菟岽x途徑合成苯丙氨酸和脂肪酸合成代謝合成丙二酰CoA開始，經(jīng)苯丙烷類途徑合成[6]。根據(jù)基因?qū)ㄉ丈锖铣傻淖饔每煞譃榻Y(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因[7]。結(jié)構(gòu)基因直接編碼花色苷生物合成途徑中的生物合成酶類，如PAL、4CL、CHS、CHI、F3H、DFR、F3′H、F3′5′H、ANS、3GT等基因；另一類是調(diào)節(jié)基因，它們調(diào)控花色苷生物合成基因的表達(dá)強(qiáng)度和模式，同時控制花色苷在時空上的變化，如AN1、AN2、JAFl3和AN11等[8]。
2 基因遺傳轉(zhuǎn)化的方法
基因轉(zhuǎn)化的主要方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[9]、基因槍法 [10]、花粉管導(dǎo)入法[11]、化學(xué)試劑誘導(dǎo)法[12]和電穿孔法[13]等。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法是迄今最可靠、最有效的轉(zhuǎn)化方法�，F(xiàn)在的轉(zhuǎn)基因再生植物中，80 %以上是用這種方法獲得的，主要有葉盤轉(zhuǎn)化法、整株感染法和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法[14]。
基因槍法又稱微彈轟擊法，是由康乃爾大學(xué)Sanford等[10]建立的基因?qū)敕椒�，其基本原理是利用亞精胺、聚乙二醇的粘附作用將外源DNA包被在微小的金�；蜴u粒表面，然后在高壓的作用下微粒被高速射入受體細(xì)胞或組織。
花粉管通道法最早由周光宇提出[11]，其基本原則是利用開花植物授粉后形成的花粉管通道使外源DNA 沿著花粉管進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞的方法。
化學(xué)誘導(dǎo)法[12]的主要原理就是聚乙二醇、多聚-L-鳥氨酸、磷酸鈣在pH值較高的條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子。
電穿孔法又稱電激法，首先由Neumann提出[13]，是在高壓電脈沖作用下，在新鮮分離的原生質(zhì)體的質(zhì)膜上形成可逆性的瞬間通道，從而發(fā)生外源DNA 的攝取。
此外，還有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、低能離子束法、病毒載體轉(zhuǎn)化法、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)法和浸泡法等。
3 花色苷基因工程改良的基本策略
花色苷合成由多個代謝步驟、多基因決定，所以利用基因工程改造花色苷一個重要策略就是還原法，即欲修飾某個性狀時，先要明確決定該性狀的特異生化物質(zhì)，然后對形成該生化物質(zhì)的代謝途徑進(jìn)行基因工程操作。具體就是分析催化各反應(yīng)步驟的酶、編碼這些酶的基因及其表達(dá)調(diào)控[15]。多步驟的代謝途徑有限速步驟，而限速步驟對整個代謝途徑起著決定性作用，所以對限速步驟的遺傳操作往往是還原法的重要突破口。增強(qiáng)某種關(guān)鍵酶的表達(dá)，往往可使花色苷合成途徑朝生成其催化產(chǎn)物的方向進(jìn)行；而抑制該酶的表達(dá)，則會使反應(yīng)朝合成途徑的另一分支進(jìn)行，導(dǎo)致另一種產(chǎn)物的積累[16]。
3.1反義抑制法
利用基因工程技術(shù)進(jìn)行花色苷修飾的常用方法是反義抑制法，首先明確決定花色苷的特異生化物質(zhì)，然后分析該生化物質(zhì)代謝途徑中催化各反應(yīng)步驟的酶，克隆編碼這些酶的基因，反向轉(zhuǎn)入到目的植株中，外源DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與內(nèi)源的互補(bǔ)mRNA結(jié)合，而抑制目的植株中這些生化物質(zhì)的合成[17]。利用該技術(shù)已在矮牽牛[17，18]、菊花[19-21]等幾種觀賞植物中進(jìn)行成功了花色修飾。
3.2共抑制法
共抑制法，又稱正義抑制法，即正向?qū)?個或幾個內(nèi)源基因的額外拷貝，反而抑制該內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的積累， 進(jìn)而抑制該內(nèi)源基因的表達(dá)[22，23]。該技術(shù)在矮牽牛[24]、菊花[19]、藍(lán)豬耳[25]等花卉的花色修飾方面已取得成功。
3.3導(dǎo)入調(diào)節(jié)基因
如果植物已具色素合成結(jié)構(gòu)基因，只是因為組織特異性或缺乏調(diào)節(jié)基因表達(dá)產(chǎn)物的激活而不表達(dá)時，導(dǎo)入調(diào)節(jié)基因并使之適當(dāng)表達(dá)可活化特定的結(jié)構(gòu)基因， 改變花色。如Quattrocchio 等[26]將系列花色苷合成的調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)入矮牽牛，獲得紅色的愈傷組織和粉紅色花色的轉(zhuǎn)化株。Kim[27]將玉米C1基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草，使株花瓣變狹長，顏色顯著變淺。
3.4導(dǎo)入新的外源基因
Meyer等[28]首次將源自玉米的編碼DQR的A1基因?qū)氚珷颗０谆ㄍ蛔凅w中，產(chǎn)生了開磚紅色花的矮牽牛。1992年澳大利亞Calgene Pacific公司與日本Sundory公司合作向薔薇中導(dǎo)入F3′5′H基因獲得成功，同年該公司在矮牽牛中導(dǎo)入該基因獲得藍(lán)色矮牽牛[29]。此外，在花色基因工程操作中，也可以導(dǎo)入調(diào)節(jié)基因以增強(qiáng)或減弱原有代謝產(chǎn)物表達(dá)，或?qū)肫渌c花成色作用有關(guān)的基因，如pH基因、輔助色素基因、細(xì)胞形狀基因等，也可以同時導(dǎo)入與某種花色有關(guān)的多種基因。
4 植物花色苷基因工程改良的安全性
植物花色色素屬次生代謝產(chǎn)物，與植物防御系統(tǒng)相關(guān)。因此，基因工程改良花色可能妨礙植物的生存。同時，無法預(yù)測外源基因在轉(zhuǎn)基因植株遺傳背景中會產(chǎn)生的作用和后果[1]，在環(huán)境安全性方面存在潛在的威脅，如轉(zhuǎn)基因花卉雜草化、產(chǎn)生對人類有害
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