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不同壓力二氧化碳氣腹對胃癌細胞增殖運動的影響
畢業論文作者：郝迎學 鐘華 曾冬竹 石彥 饒蕓 周立新 余佩武
【摘要】 目的 通過體外模擬氣腹環境，觀察不同壓力CO2對胃癌細胞MKN?45增殖、運動的影響。方法 將MKN?45細胞置于充滿CO2的密閉培養箱中，按CO2壓力不同分為對照組、0、5、10和15 mm Hg組(1 mm Hg=0.133 kPa)，作用時間均為4 h。用血氣分析儀檢測培養液pH值；MTT法檢測細胞增殖情況；流式細胞儀觀察細胞周期變化；Transwell法觀察細胞遷移運動變化。結果 0、5、10和15 mm Hg組細胞培養液在0 h呈酸性。MTT法檢測細胞增殖發現0、5、10 mm Hg組與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，15 mm Hg組與對照組比較吸光度(OD)值在1～3 d差異無統計學意義(t=0.625,-0.537,0.137,P＞0.05)，在4～7 d差異有統計學意義(t=26.622,13.376,18.839,7.595,P＜0.01)。0、5、10 mm Hg組細胞增殖指數和細胞穿過濾膜的數量與對照組比較差異無統計學意義(t=1.134,-0.538,-0.829;t=0.330,0.794,0.508,P>0.05)，15 mm Hg組與對照組比較差異有統計學意義(t=11.225,8.775,P<0.01)。結論 在15 mm Hg壓力下，CO2對MKN?45細胞增殖、運動起抑制作用。
【關鍵詞】 氣腹； 胃腫瘤； 細胞增殖； 細胞周期； 細胞運動
【Abstract】 Objective To investigate the effects of CO2 pneumoperitoneum with different pressures on the proliferation and motility of cultured human gastric cancer cell line MKN?45 in vitro. Methods According to different CO2 pressures, gastric cancer cell line MKN?45 was divided into 0 mm Hg group, 5 mm Hg group, 10 mm Hg group, 15 mm Hg group and control group. The pH value of cell culture medium, proliferation, changes of cycle and migration of gastric cancer cells was detected by blood gas analyzer, MTT assay, flow cytometry and Transwell method, respectively 4 hours later after CO2 insufflation. Results The pH values of culture medium in 0 mm Hg, 5 mm Hg , 10 mm Hg and 15 mm Hg group were lower than 7 at hour 0. No statistical difference of gastric cancer cell proliferation was seen between 0 mm Hg, 5 mm Hg, 10 mm Hg group and control group (P>0.05). The difference of optical density had no statistical difference between 15 mm Hg group and control group from day 1 to day 3 (t=0.625, -0.537, 0.137, P>0.05), but had statistical difference from day 4 to day 7 (t=26.622, 13.376, 18.839, 7.595,P<0.01). In regard of cell proliferation and number of cells migrated through the filter membrane, there was no statistical difference between groups 0 mm Hg, 5 mm Hg, 10 mm Hg and control group (t=1.134, -0.538, -0.829; t=0.330, 0.794, 0.508, P>0.05), but significant statistical difference between 15 mm Hg group and control group (t=11.225, 8.775, P<0.01). Conclusions CO2 pneumoperitoneum has inhibitory effect on proliferation and motility of gastric cancer cell line MKN?45 under 15 mm Hg pressure.
【Key words】 Pneumoperitoneum; Stomach neoplasm; Cell proliferation; Cell cycle; Cell motility
腹腔鏡胃癌根治術治療早期胃癌已取得滿意的近、 遠期效果［1］。但對腫瘤已侵及漿膜的進展期胃癌是否可施行腹腔鏡胃癌根治術仍存在不同看法。主要原因是該手術是否會促進胃癌細胞的播散轉移尚有爭論，特別是作為常用氣腹介質CO2對胃癌細胞生物學行為的影響目前仍不10分清楚。本研究應用CO2體外模擬氣腹環境，觀察其對胃癌細胞增殖運動的影響。
1 材料與方法
1.1 細胞培養及分組
胃癌MKN?45細胞(購自第4軍醫大學西京醫院全軍消化研究所)常規培養于RPMI 1640培養液中。實驗分為5組，對照組：培養板直接放入37 ℃、5% CO2孵箱中；0 mm Hg組：將培養板置于充滿CO2的壓力箱中， 調節壓力為0 mm Hg； 5、10、15 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)組則將培養板分別置于壓力為5、10、15 mm Hg的壓力箱中。5組孵育時間均為4 h。
1.2 體外模擬CO2氣腹環境的建立
將60 cm×40 cm×30 cm的密閉保鮮箱改造成密閉培養箱，側壁的1面靠近底部開有1個進氣孔，另1面靠近頂部處開有1個出氣孔；進氣孔通過1根橡膠軟管與氣腹機出氣口相連，氣腹機進氣口與高純度的CO2鋼瓶減壓閥相連。建立CO2氣腹時通入高純度CO2(流量為5～8 L/min)持續1 h。1 h 后如氣體分壓儀顯示壓力箱內的CO2濃度＞99%，即說明壓力箱內已達到純CO2的條件。此時可關閉出氣孔，調整氣體流量至需要的壓力并保持。
1.3 血氣分析儀測定培養液pH值
將處于對數生長期的MKN?45細胞消化、重懸，調整細胞濃度為2.0×105個/ml。分別取1 ml加入24孔培養板中，每孔含細胞2.0×105個。置入密閉培養箱內培養4 h，分別于排氣后0、2、4、6、10 h取各組培養液各1 ml，用血氣分析儀測pH值，每組4孔，取均值。
1.4 MTT法檢測細胞增殖活性
調整細胞濃度為1.0×104個/ml，分別取200 μl加入96孔培養板中。分別于排氣后第1～7天檢測細胞增殖活性，于檢測前4 h在96孔培養板中分別加入MTT溶液20 μl，4 h后吸出培養液和MTT溶液，再分別加入150 μl2甲基亞砜，混勻后于酶標儀490 nm測吸光度(OD)值，每天測8個復孔，取均值。
1.5 流式細胞儀檢測細胞周期變化
用流式細胞儀檢測細胞周期前，振蕩器使細胞分散并將細胞滴入75%乙醇，邊滴邊振蕩，放入4 ℃冰箱固定12 h，加入碘化丙啶，置500目尼龍網過濾，再用流式細胞儀分析。
1.6 Transwell法檢測細胞遷移率
細胞消化、重懸、分組同血氣分析。用不含血清的培養液調整細胞濃度為2.0×105個/ml，取400 μl含細胞的無血清培養液放入Boyden小室中，將小室置入預先加入600 μl含10%血清培養液的24孔培養板中，常規培養6 h后將培養板置入壓力培養箱中，4 h后取出培養板再常規培養6 h，甲醇固定，蘇木精染色，400倍顯微鏡隨機選取5個視野計數遷移至下層小室細胞數，取均值。
1.7 統計學分析
計量資料以±s表示，采用SPSS 10.0統計軟件進行獨立樣本t檢驗及單因素方差分析F檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 培養液pH值變化
0、5、10和15 mm Hg組與對照組比較，處理后0 h培養液pH值明顯降低，壓力越大，降低越明顯；連續檢測處理后第2、4、6、8、10小時，發現在移至正常培養環境后，各組pH值很快恢復正常，其中15 mm Hg組恢復最慢，為處理后6 h恢復正常(圖1)。
圖1 不同壓力下各組細胞培養液pH值隨時間的變化
2.2 細胞增殖活性變化
0、5、10 mm Hg組與對照組OD值比較差異無統計學意義(P＞0.05)；15 mm Hg組與對照組OD值比較在1～3 d差異無統計學意義(t=0.625，-0.537，0.137,P＞0.05)，在4～7 d下降非常顯著，差異有統計學意義(t=26.622，13.376，18.839， 7.595，P＜0.01)。
2.3 細胞周期變化
根據流式細胞儀分析結果計算各組細胞增殖指數(profile index，PI)，計算公式為PI=(S+G2/G1+S+G2+M)×100%。結果0、 5、 10 mm Hg組與對照組PI比較差異無統計學意義 (t=1.134， -0.538，-0.829，P＞0.05)；15 mm Hg組PI明顯小于對照組，差異有統計學意義(t=11.225，P＜0.05)。
2.4 細胞遷移率變化
0、5、10 mm Hg組細胞處理后6 h穿過濾膜的數量分別為123±18.28、133±10.31、126±6.50，與對照組的122±21.93比較差異無統計學意義(t=0.330，0.794，0.508，P＞0.05)；15 mm Hg組為22±12.87， 較對照組明顯減少(t=8.775，P＜0.01)(圖2，3)。
3 討論
雖然腹腔鏡胃癌手術時間較傳統開腹手術長，但因有術后疼痛輕、胃腸功能恢復快、住院時間短、腹壁瘢痕小及對機體免疫功能影響小等優點，顯示了腹腔鏡手術的優越性［2-3］。我科自2004年3月開展腹腔鏡胃癌根治術以來，已行腹腔鏡胃癌根治術302例，其中進展期胃癌236例，近期效果良好。在腫瘤切除范圍、淋巴結清掃數目等方面與開腹手術無明顯差別［4］。
但是，目前進展期胃癌行腹腔鏡胃癌根治術發展仍然緩慢，主要原因是對腹腔鏡手術是否會促進腫瘤細胞在腹腔內播散及戳孔種植轉移存在爭議。目前，有關CO2氣腹對腫瘤細胞生物學行為影響的報道很不1致。Takiguchi等［5］報道CO2氣腹會促進腫瘤細胞的增殖和生長，包括結直腸癌、腺癌和其他惡性腫瘤。Leng等［6］報道體外模擬CO2氣腹環境，培養的卵巢癌HO8910細胞和SKOV3細胞會隨著壓力的升高、時間的延長，其凋亡的比例增加。徐春陽等［7］報道在CO2氣腹條件下，早期抑制子宮內膜癌HTB?113細胞的生長，而在處理后的5～12 d促進癌細胞的生長。Gutt等［8］報道在充氣后1～4 d胰腺癌細胞DAN?G和結腸癌細胞CX?2生長明顯受到抑制，而在第5～15天兩種癌細胞增殖明顯加快，DAN?G細胞的增殖獨立于氣腹壓力，而CX?2細胞的增殖則依賴于CO2的壓力。我們的研究發現，胃癌細胞MKN?45在低CO2壓力條件下，其增殖活性與對照組比較差異無統計學意義，而在15 mm Hg條件下其增殖活性明顯低于對照組。我們對細胞培養液的pH值檢測中發現，15 mm Hg組細胞培養液pH值變化較大，恢復正常需要約6 h。其機制可能為在嚴重缺氧狀態下，缺氧誘導因子1?α磷酸化與HIF?1β分離，和P53結合促進細胞凋亡的發生［9］。
我們在實驗中還發現，在0、5、10 mm Hg組MKN?45細胞遷移通過Boyden小室8 μm濾膜的數目較對照組稍多，但差異無統計學意義。而15 mm Hg組MKN?45細胞遷移率明顯少于對照組(P＜0.01)。我們分析這可能與15 mm Hg組細胞大部分發生凋亡有關，而較高壓力是否會影響腫瘤細胞的運動能力還需要進1步研究。
我們的研究結果顯示，在臨床常用的氣腹壓力(≤10 mm Hg)下CO2不會促進胃癌細胞的生長和遷移，而在較高氣腹壓力(15 mm Hg)下CO2抑制胃癌細胞的增殖和運動。
【參考文獻】
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［9］ Suzuki H
[1]
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