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淺論川芎嗪對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能影響
畢業(yè)論文作者(冒號(hào))：林杰 徐力辛 楊德業(yè) 黃偉劍 林捷 張懷勤
【摘要】 ［目的］觀察川芎嗪（TMP）對(duì)體外培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）功能影響和損傷保護(hù)作用，探討它對(duì)冠心病的治療作用。［方法］密度梯度離心法獲取臍血單個(gè)核細(xì)胞,培養(yǎng)7天后,收集貼壁細(xì)胞，流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡法、matrigel試劑鑒定EPCs。收集貼壁細(xì)胞并分組為正常對(duì)照組，TMP（5mg/L、25mg/L、100mg/L、200mg/L）干預(yù)組，H2O2（500μmol/L）氧化應(yīng)激模型組，TMP（5mg/L、25mg/L、100mg/L、200mg/L）和H2O2共同干預(yù)組，培養(yǎng)24h。分別觀察EPCs增殖、粘附能力及凋亡率。［結(jié)果］與正常對(duì)照組相比,（5mg/L、25mg/L、100mg/L）TMP干預(yù)組對(duì)臍血來(lái)源的EPCs增殖、粘附功能無(wú)顯著影響，（200mg/L）TMP干預(yù)組顯著抑制臍血來(lái)源的EPCs增殖、粘附；與H2O2氧化應(yīng)激損傷組相比，（5mg/L、25mg/L、100mg/L）TMP能顯著降低H2O2對(duì)EPCs增殖、粘附抑制作用及細(xì)胞凋亡。［結(jié)論］低濃度TMP能保護(hù)EPCs氧化應(yīng)激損傷，改善增殖、粘附能力，減少細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常培養(yǎng)的EPCs增殖和粘粘功能無(wú)顯著的促進(jìn)或抑制作用。
【關(guān)鍵詞】 川芎嗪 內(nèi)皮祖細(xì)胞 過(guò)氧化氫 缺血性疾病 冠心病
Abstract(冒號(hào))：［Objective］ This study was to investigate the effect of TMP on function of EPCs in normal or hydrogen peroxide（H2O2）inducing injury model cell culture，and to approach a therapy to coronary heart disease（CHD）.［Method］ Total mononuclear cells were isolated from the cord blood by ficoll density gradient centrifugation，cultured in vitro.After the cells cultured for 7 days，identified them by cellmarkers and the ability of intaking the ac?LDL，and made sure they were EPCs.To divide the cells into three groups，TMP（5,25,100，200mg），H2O2（500μΜ）model and TMP together with H2O2，cultured for 24h and then detected the function and apoptosis of EPCs.［Result］ Versus to control group，the TMP （5，25，100mg）groups had no important effect on the proliferation and adhesion of EPCs，but TMP （200mg）group had negative effect on EPCs.Versus to H2O2 model group，TMP （5，25,100mg）preincubated groups had important protective effect on EPCs in proliferation，adhesion and apoptosis.［Conclusion］ TMP could protect EPCs from oxidative stress injury，but had little benefit to EPCs in normal incubation.
Key words(冒號(hào))：tetramethylpyrazine；endothelial progenitor cell；hydrogen peroxide；ischemic disease；coronary heart disease
內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的概念提出已有10年，目前普遍認(rèn)為EPCs的表面標(biāo)記為CD34、CD133、KDR，能進(jìn)1步分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞參與血管新生的干/祖細(xì)胞。川芎嗪（TMP）是從活血化瘀中藥川芎的根莖中提取的有效成分,對(duì)臍靜脈內(nèi)皮具有促增殖和內(nèi)皮損傷保護(hù)作用［1］，并能抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖及新生血管形成［2］，已應(yīng)用到部分臨床心、腦血管等疾病的治療并取得較好的療效［3］。而TMP對(duì)EPCs功能影響和損傷及保護(hù)作用，尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察TMP對(duì)體外培養(yǎng)正常和損傷EPCs的功能影響。
1 材料和方法
1.1 材料 6％羥乙基淀粉購(gòu)自Sigma公司，纖維連接蛋白購(gòu)自Roche公司，VEGF購(gòu)自PeprotechEC公司，PE?CD34購(gòu)自Caltag laboratories,FITC－VE?cadherin購(gòu)自Bender system公司，PE?VEGF?2及FITC?AC133購(gòu)自R＆D System,胎牛血清、購(gòu)自GIBCO公司，Dil?ac?LDL購(gòu)自Molecular probe公司，F(xiàn)ITC?UEA、TMP購(gòu)自Sigma公司，CCK?8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所，matrigel購(gòu)自BD biosciences公司。
1.2 方法
1.2.1 人臍血培養(yǎng)EPCs臍血采集于溫州醫(yī)學(xué)院附屬第1醫(yī)院產(chǎn)科分娩室（已獲得知情同意）。培養(yǎng)參考文獻(xiàn)［4］，取健康孕婦分娩后臍血50ml,以密度梯度離心法分離臍血中單個(gè)核細(xì)胞,以5×107cells度接種于包被有纖維連接蛋白的25cm2培養(yǎng)瓶中,每皿加入5ml包含有20%胎牛血清、VEGF（10μg·L-1）,青霉素（105U/L）及鏈霉素（105U/L）的M199培養(yǎng)液,置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后,洗去未貼壁細(xì)胞,添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),以后每隔3d換培養(yǎng)液。
1.2.2 EPCs鑒定 在培養(yǎng)第3天時(shí)形成細(xì)胞集落；在培養(yǎng)的第7天細(xì)胞以0.25%胰酶消化后,制成109·L-1的單細(xì)胞懸液,加入熒光標(biāo)記的抗CD34、VE?Cadherin、VEGFR?2及CD133單克隆抗體各10μl（1g·L-1）,流式細(xì)胞儀分析其表達(dá)情況；將DiI?ac?LDL以2.4mg·L-1的終濃度加入培養(yǎng)液共孵育3h,2％的多聚甲醛固定10min,再加入3ulFITC?UEA,（避光操作），37℃孵育1h，熒光顯微鏡下觀察，以不加DiI?ac?LDL和FITC?UEA的同批培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)照，陰性對(duì)照采用SGC7901；將matrigel試劑、96孔培養(yǎng)板以及槍頭于4℃冰箱過(guò)夜，在冰上操作，取50ulmatrigel試劑每孔，于37℃孵育半小時(shí)成膠待用，0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液接種于鋪好成血管試劑的96孔板，培養(yǎng)48h在倒置顯微鏡下觀察管腔形成
1.2.3 分組 培養(yǎng)第7天的各組細(xì)胞以0.25%胰酶消化后,制成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，分為正常對(duì)照組、TMP（5mg/L、25mg/L、100mg/L、200mg/L）干預(yù)組、H2O2（500umol/L）氧化應(yīng)激模型組［6］、TMP（5mg/L、25mg/L、100mg/L）預(yù)處理6h后和H2O2共同干預(yù)組，共培養(yǎng)24h后進(jìn)行增殖、粘附功能及細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。
1.2.4 增殖能力測(cè)定 制成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，將等數(shù)量EPCs接種到96孔培養(yǎng)板隨機(jī)分為各組,每組6孔,培養(yǎng)48h后,棄培養(yǎng)液加入100μl新鮮含3％胎牛血清M199培養(yǎng)液，每孔10μLcck?8，37℃培養(yǎng)2.5h后,置酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450nm處測(cè)吸光度值（A）。
1.2.5 粘附能力測(cè)定 制成細(xì)胞懸液,以為1×104/cm2的接種密度接種到24孔板,分為各組每組3孔,培養(yǎng)48h后,各組細(xì)胞以0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液，以相同細(xì)胞數(shù)接種96孔板每組6孔,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min,洗去未貼壁細(xì)胞,倒置顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野（×400）計(jì)數(shù)粘附細(xì)胞數(shù)。
1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 在培養(yǎng)的第7天之后，以0.25%胰酶消化下來(lái)制成細(xì)胞懸液,以5×105cells接種6孔板，0.25%胰酶（不含EDTA）將各孔細(xì)胞消化,PBS洗兩次成細(xì)胞懸液,收集1×105cells離心，加入500μl Binding Buffer重懸浮細(xì)胞，加入2μl Annexin V?FITC混勻后，加入5μl Propidium Iodide（PI）染料，混勻、避光、室溫反應(yīng)10min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。Annexin v單陽(yáng)性為早期凋亡細(xì)胞，以正常組早期凋亡率為100％,計(jì)算各組與正常組早期凋亡率之比。
1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 所有結(jié)果以x±s表示,輸入SPSS13.0軟件包，采用單因素方差分析比較各組均數(shù),P<0.05為有顯著性差異。
2 結(jié)果
2.1 EPCs鑒定 培養(yǎng)3d后形成集落（圖4），培養(yǎng)第7天用流式細(xì)胞儀分析表明,表達(dá)CD34、CD133、VEGFR?2、VE?Cadherin的細(xì)胞分別為（78.51±5.53）%、（10.15±4.45）%、（15.24±3.61）%及（64.48±6.56）%。熒光顯微鏡檢顯示(冒號(hào))：細(xì)胞吞噬DiI?ac?LDL，顯微鏡下激發(fā)紅色熒光（圖1）,細(xì)胞吞噬FITC?UEA，發(fā)綠色熒光（圖2），兩圖重疊見(jiàn)圖3�？瞻讓�(duì)照及陰性對(duì)照均無(wú)熒光。血管生成matrigel試劑盒檢測(cè)EPCs的體外成血管能力。細(xì)胞拉長(zhǎng)變形,長(zhǎng)度為寬度的4倍以上即可被認(rèn)為形成小管狀，典型血管狀為梭形細(xì)胞圍成的多邊形官腔樣（圖5）。體外培養(yǎng)14d后可形成條索狀結(jié)構(gòu)（圖6）。
2.2 對(duì)EPCs增殖、粘附功能的影響 由表1可知，與對(duì)照相比，TMP在5～200mg/L濃度范圍內(nèi)，低濃度的TMP對(duì)EPCs增殖、粘附能力無(wú)顯著促進(jìn)或抑制，高濃度TMP則抑制EPCs增殖、粘附功能；與H2O2氧化應(yīng)激模型相比，低濃度的TMP可顯著降低H2O2對(duì)EPCs的增殖、粘附功能損傷。
2.3 對(duì)EPCs早期凋亡率的影響 由表1可知，TMP在濃度5～100mg/L范圍內(nèi)對(duì)H2O2致EPCs凋亡起保護(hù)作用。
圖1 細(xì)胞吞噬DiI?ac?LDL（×100）（略）
圖2 細(xì)胞吞噬FITC?LEA（×100）（略）
圖3 DiI?ac?LDL與FITC?LEA重疊熒光圖（略）
圖4 培養(yǎng)3d后形成集落（×100）（略）
圖5 多邊形官腔樣（×100）（略）
圖6 14d后形成條索狀結(jié)構(gòu)（略）
表1 不同濃度的TMP對(duì)外周血EPCs的增殖、粘附功能及凋亡影響（略）
Note(冒號(hào))：Versus to control group，*P<0.05，**P<0.01,Versus to H2O2 group,△P<0.05，△△P<0.01
3 討論
從1997年ashara等［7］發(fā)現(xiàn)成體存在皮祖細(xì)胞，EPCs作為1種可以形成新生血管和分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的種子細(xì)胞的研究方興未艾并取得了1系列巨大的研究成果。臨床上缺血性疾病尤其是冠心病往往合并有1種或多種心血管疾病危險(xiǎn)因素。心血管危險(xiǎn)因素的數(shù)量與循環(huán)中的EPCs的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，因而有學(xué)者認(rèn)為循環(huán)中EPCs的數(shù)量可以作為冠心病預(yù)后的指標(biāo)。提示提高循環(huán)中EPCs的數(shù)量和改善其功能有助于防治心血管疾病。Dernbach等［6］研究發(fā)現(xiàn)與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞相比EPCs具有較低的活性氧水平，以往實(shí)驗(yàn)已證明氧化應(yīng)激損傷可縮短端粒，促使細(xì)胞衰老、凋亡［9］。而TMP對(duì)冠脈內(nèi)皮損傷、缺血再灌注心肌損傷的保護(hù)作用與超氧歧化酶、1氧化氮合酶水平顯著升高相關(guān)作用［10］。
本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低濃度的TMP對(duì)正常培養(yǎng)EPCs增殖、粘附功能無(wú)顯著促進(jìn)或抑制，高濃度則起抑制作用。H2O2是活性氧，促進(jìn)大量氧化自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷細(xì)胞活性，促使細(xì)胞衰老及凋亡。低濃度TMP和H2O21起干預(yù)培養(yǎng)很顯著降低H2O2對(duì)EPCs活性抑制。推測(cè)TMP對(duì)EPCs損傷保護(hù)作用可能同清除氧化自由基，抑制胞內(nèi)鈣超載，增強(qiáng)抗氧化酶的活性，抑制端粒加速縮短有關(guān)，具體的調(diào)節(jié)途徑有待能進(jìn)1步實(shí)驗(yàn)明確。本實(shí)驗(yàn)為TMP對(duì)治療合并有高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化的冠心病可行性提供了1定的理論支持。
【參考文獻(xiàn)】
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