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石蠟切片中BCL┐6抗原失活機制及修復
作者：張永清 黃高升日 趙一嶺 王哲 閆慶國 郭英【關鍵詞】 抗原修復
關鍵詞: 抗原修復;免疫組織化學;BCL-6;淋巴組織增生
摘 要:目的 探討石蠟切片中BCL-6抗原失活機制及修復的最佳方法. 方法 淋巴組織反應性增生11例石蠟切片分別用二乙胺四乙酸（EDTA）、檸檬酸、碳酸鈉及去離子水4種與鈣離子結合力不同的修復液，結合高壓、微波和煮沸3種不同方法修復后，比較檢出的BCL-6陽性率及強度. 結果 BCL-6陽性率由高至低依次為:EDTA0.73>檸檬酸0.45（P<0.01）>碳酸鈉0.12（P<0.01），去離子水組無1例陽性.高壓修復陽性率0.55>微波修復0.28和煮沸修復0.12（P<0.05）.不同修復液與高壓結合修復檢出BCL-6陽性率及強度:EDTA與檸檬酸陽性率分別為1，0.82（P>0.05），高于碳酸鈉組（0.36）和去離子水組（0）（P<0.01）.EDTA組強陽性占0.82，顯著高于其他各組（P<0.01）. 結論 EDTA結合高壓是修復BCL-6抗原的理想方法，鈣離子的參與可能是甲醛固定后BCL-6抗原失活的原因之一.
Keywords:antigen retrieval;immunohistochemistry;BCL-6;lymphoproliferation
Abstract:AIM To study the ideal method of retrieving the antigenic activity of BCL-6in paraffin sections and the possible mechanism of the antigen masking.METHODS Paraffin-embedded sections from11cases of lymphoid reac-tive hyperplasia were retrieved respectively by four retrieving solutions with different combining power with calcium:ED-TA，citrate，sodium carbonate（SC）and deionized water（DW），which with different retrieval methods:high pressure（HP），microwaving（MW）and stove boiling（SB），and the antigenic activities were detected by immunohistochemistry.RESULTS The positive percentage in sections retrieved by EDTA，citrate and SC were0.73，0.45and0.12respective-ly.The difference among the groups was significant（P<0.01）;the group of DW showed all negative.0.55of HP group was positive，which was higher than0.28of MW group and0.15of SB group（P<0.05and P<0.01）.The positive incidences of sections retrieved by HP with EDTA and HP with citrate were1and0.82respectively，which were higher than HP with SC（0.36）and HP with DW（0）（P<0.01）.0.82of HP with EDTA was intensive positive，the difference in positive intensity between HP with EDTA group and above mentioned groups was significant（P<0.01）.CONCLUSION HP with EDTA is the ideal method for retrieving antigenic activity of BCL-6by formalin-fixa-tive，suggesting that calcium may be involved in the antigen masking.
0 引言
BCL-6是位于染色體3q27原癌基因bcl-6編碼的核內(nèi)轉錄因子，由706個氨基酸組成，主要表達于淋巴組織生發(fā)中心B細胞及部分T細胞［1］ .研究證實，bcl-6剔除鼠不能形成生發(fā)中心［2］ ，其基因調(diào)控區(qū)發(fā)生易位或（和）突變與B細胞淋巴瘤發(fā)生有關［3，4］ ，BCL-6表達失調(diào)可引起細胞凋亡及彌漫性大B細胞淋巴瘤發(fā)生［5，6］ .檢測BCL-6表達有助于淋巴瘤的診斷和鑒別診斷［7］ .然而，40g・L-1 甲醛固定后的BCL-6抗原不經(jīng)修復極難檢出.我們用免疫組化方法比較一組反應性增生淋巴組織石蠟切片，分別用EDTA、檸檬酸、碳酸鈉及去離子水4種修復機制不同的修復液，結合高壓、微波及煮沸3種常用方法的修復效果，探討B(tài)CL-6抗原失活機制及修復的理想方法.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 標本來源及處理 2000-02/2000-06收集西京醫(yī)院病理科扁桃體炎標本7例，反應性增生淋巴結標本4例.經(jīng)40g・L-1 甲醛固定24h，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，切片置60℃烤箱過夜（切片用APES膠預處理）.
1.1.2 修復液及配制 1mmol・L-1 pH8.0ED-TA溶液:0.37g EDTA溶于1L蒸餾水，調(diào)pH值至8.0;10mmol・L-1 ，pH6.0檸檬酸鹽溶液、1.5mmol・L-1 pH8.0碳酸鈉溶液分別參照Cattoretti等［9］ 及Morgan等［8］ 的方法配制;去離子水用美國Millipore公司制純水器生產(chǎn).
1.2 方法 高壓修復參照Norton等［10］ 方法:1.5L修復液入壓力鍋中，加熱至沸騰.將脫蠟至水切片置于金屬架上，浸入鍋內(nèi)修復液中，蓋壓力鍋閥，加熱至壓力鍋噴氣后1min，停止加熱，冷水浸至室溫.微波修復參照Cattoretti等［9］ 方法:將脫蠟至水切片放入盛有修復液的染缸中，置醫(yī)用微波爐內(nèi)中低檔加熱10min，取出冷卻至室溫.煮沸修復法:將脫蠟至水切片浸入盛修復液的燒杯中，燒杯置于盛有自來水的鋁鍋內(nèi)，電爐上加熱，燒杯中溫度達97℃后開始計時，15min后停止加熱，冷至室溫.
1.3 免疫組化檢測及結果判斷 BCL-6mAb購自英國Novocastra公司，工作濃度1∶20.EnVisionTM 及催化信號擴增（catalyzed signal amplification，CSA）免疫組化試劑盒購自Dako公司，按說明操作.11份標本各切片13張，分13組.其中一組不修復，用CSA試劑盒檢測.另12組用不同的修復液及修復方法修復，運用Dako EnVisionTM 兩步法檢測.TBS替代一抗作陰性對照.陽性強度評價采用半定量方法，陰性不著色（-），淡黃色為陽性（+），棕黃色顆�；驁F塊為強陽性（）（著色部位位于胞核）.
統(tǒng)計學處理:實驗結果采用χ2 檢驗.
2 結果
2.1 未經(jīng)修復組檢測結果 用CSA試劑盒檢測未修復組，抗BCL-6免疫組化染色均為陰性（Fig1）. 2.2 不同方法修復后BCL┐6檢測結果 經(jīng)EDTA、檸檬酸、碳酸鈉及去離子水4種修復液，分別用高壓、微波及煮沸3種修復方法處理后，EDTA組陽性率顯著高于檸檬酸組（P<0.01），后者又高于碳酸鈉組 和去離子水組（P<0.01）.3種修復方法比較，高壓修復陽性率高于微波修復組（P<0.05）和煮沸組（P<0.01）.且高壓修復無組織脫片現(xiàn)象，其他修復方法均有不同程度的脫片（Tab1）.圖1 － 圖2 略
表1 不同方法修復后BCL-6檢測結果 略
2.3 高壓配合不同修復液的修復效果 EDTA或檸檬酸結合高壓修復方法，檢出BCL-6陽性率分別為100%和81%（P>0.05），顯著高于碳酸鈉組及去離子水組（Tab2，P<0.01）.EDTA組11例陽性中有9例為強陽性表達（Fig2），高于其他各組（P<0.01，Tab2）.
3 討論
用靈敏度50余倍標準LSAB（labeled strepta-vidin biotin）的CSA試劑盒（見說明書）檢測未經(jīng)修復的11例石蠟切片，結果全為陰性，提示100g・L-1 甲醛固定后的石蠟切片中BCL-6抗原活性基本丟失.較多研究認為石蠟切片不能較好地顯示抗原的原因，不是抗原破壞，而是抗原受到遮蔽.不同抗原遮蔽的主要原因亦不相同，因此所用的修復液和修復方法也應有所不同［9］ .Morgan等［8］ 推測引起抗原遮蔽的主要原因有:①40g・L
-1 甲醛固定過程中產(chǎn)生的甲酸可與某些蛋白質(zhì)位點發(fā)生十字交聯(lián)形成亞甲基橋.高溫下這種亞甲基橋可在水溶液中水解，抗原活性重新暴露.②一些蛋白質(zhì)在40g・L-1 甲醛固定和高溫浸蠟過程中，其三級結構發(fā)生改變，使原本暴露的抗原隱藏起來.③某些蛋白質(zhì)在40g・L-1 甲醛固定時產(chǎn)生大量羥基、羧基及磷酰基基團，這些基團易與動物組織中豐富的鈣離子緊密結合形成復合物，引起抗原遮蔽.
表2 不同修復液結合高壓修復后檢出BCL-6的陽性狀況 略
用BCL-6mAb檢測經(jīng)修復后淋巴組織石蠟切片中BCL-6抗原表達情況，國外雖有報道，但所用修復液及修復方法各不相同［11，12］ ，目前尚未見探討40g・L-1 甲醛固定后BCL-6抗原失活機制及理想修復方法的報道.我們用微波、高壓、煮沸3種常用修復方法對4種修復機制不同的修復液的修復效果進行了比較，發(fā)現(xiàn)EDTA溶液對40g・L-1 甲醛固定后的BCL-6抗原活性修復能力最強，其次為檸檬酸溶液，碳酸鈉鹽只有較弱的修復作用，去離子水沒有修復作用.EDTA和檸檬酸均為鈣離子強螯合劑.碳酸鈉鹽亦有鈣離子沉淀作用.而去離子水無結合鈣離子作用.以上結果表明，經(jīng)40g・L-1 甲醛固定后石蠟切片中BCL-6抗原失活的主要機制可能與鈣離子復合物形成有關.對4種不同的修復液結合3種常用修復方法的修復效果進行檢驗表明，高壓修復效果最好，可能在高壓狀態(tài)下鈣離子與蛋白質(zhì)抗原形成的復合物更易解離.對4種修復液結合高壓修復的效果進行驗證，發(fā)現(xiàn)差異懸殊.EDTA溶液結合高壓修復法修復BCL-6抗原后，其檢出陽性率及陽性強度均高于其他各組，是修復石蠟切片中BCL-6抗原活性 的最隹方法.此法經(jīng)濟方便，操作簡單，為進一步研究BCL-6抗原失活及修復機制，以及研究其表達意義打下了良好基礎.
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