石蠟切片中BCL┐6抗原失活機制及修復

石蠟切片中BCL┐6抗原失活機制及修復

                  作者：張永清　黃高升日　趙一嶺　王哲　閆慶國　郭英 

【關鍵詞】  抗原修復
　　關鍵詞: 抗原修復;免疫組織化學;BCL-6;淋巴組織增生 
　　摘 要:目的  探討石蠟切片中BCL-6抗原失活機制及修復的最佳方法. 方法  淋巴組織反應性增生11例石蠟切片分別用二乙胺四乙酸（EDTA）、檸檬酸、碳酸鈉及去離子水4種與鈣離子結合力不同的修復液，結合高壓、微波和煮沸3種不同方法修復后，比較檢出的BCL-6陽性率及強度. 結果  BCL-6陽性率由高至低依次為:EDTA0.73>檸檬酸0.45（P<0.01）>碳酸鈉0.12（P<0.01），去離子水組無1例陽性.高壓修復陽性率0.55>微波修復0.28和煮沸修復0.12（P<0.05）.不同修復液與高壓結合修復檢出BCL-6陽性率及強度:EDTA與檸檬酸陽性率分別為1，0.82（P>0.05），高于碳酸鈉組（0.36）和去離子水組（0）（P<0.01）.EDTA組強陽性占0.82，顯著高于其他各組（P<0.01）. 結論  EDTA結合高壓是修復BCL-6抗原的理想方法，鈣離子的參與可能是甲醛固定后BCL-6抗原失活的原因之一. 
      
      
　　Keywords:antigen retrieval;immunohistochemistry;BCL-6;lymphoproliferation
     
　　Abstract:AIM To study the ideal method of retrieving the antigenic activity of BCL-6in paraffin sections and the　possible mechanism of the antigen masking.METHODS Paraffin-embedded sections from11cases of lymphoid reac-tive hyperplasia were retrieved respectively by four retrieving solutions with different combining power with calcium:ED-TA，citrate，sodium carbonate（SC）and deionized water（DW），which with different retrieval methods:high pressure（HP），microwaving（MW）and stove boiling（SB），and the antigenic activities were detected by immunohistochemistry.RESULTS The positive percentage in sections retrieved by EDTA，citrate and SC were0.73，0.45and0.12respective-ly.The difference among the groups was significant（P<0.01）;the group of DW showed all negative.0.55of HP group was positive，which was higher than0.28of MW group and0.15of SB group（P<0.05and P<0.01）.The positive incidences of sections retrieved by HP with EDTA and HP with citrate were1and0.82respectively，which were higher than HP with SC（0.36）and HP with DW（0）（P<0.01）.0.82of HP with EDTA was intensive positive，the difference in positive intensity between HP with EDTA group and above mentioned groups was significant（P<0.01）.CONCLUSION HP with EDTA is the ideal method for retrieving antigenic activity of BCL-6by formalin-fixa-tive，suggesting that calcium may be involved in the antigen masking.
     
　　0 引言
     
　　BCL-6是位于染色體3q27原癌基因bcl-6編碼的核內轉錄因子，由706個氨基酸組成，主要表達于淋巴組織生發中心B細胞及部分T細胞［1］ .研究證實，bcl-6剔除鼠不能形成生發中心［2］ ，其基因調控區發生易位或（和）突變與B細胞淋巴瘤發生有關［3，4］ ，BCL-6表達失調可引起細胞凋亡及彌漫性大B細胞淋巴瘤發生［5，6］ .檢測BCL-6表達有助于淋巴瘤的診斷和鑒別診斷［7］ .然而，40g・L-1 甲醛固定后的BCL-6抗原不經修復極難檢出.我們用免疫組化方法比較一組反應性增生淋巴組織石蠟切片，分別用EDTA、檸檬酸、碳酸鈉及去離子水4種修復機制不同的修復液，結合高壓、微波及煮沸3種常用方法的修復效果，探討BCL-6抗原失活機制及修復的理想方法.
     
　　1 材料和方法 
　　1.1 材料
     
　　1.1.1 標本來源及處理  2000-02/2000-06收集西京醫院病理科扁桃體炎標本7例，反應性增生淋巴結標本4例.經40g・L-1 甲醛固定24h，常規石蠟包埋，4μm厚連續切片，切片置60℃烤箱過夜（切片用APES膠預處理）.
     
　　1.1.2 修復液及配制  1mmol・L-1 pH8.0ED-TA溶液:0.37g EDTA溶于1L蒸餾水，調pH值至8.0;10mmol・L-1 ，pH6.0檸檬酸鹽溶液、1.5mmol・L-1 pH8.0碳酸鈉溶液分別參照Cattoretti等［9］ 及Morgan等［8］ 的方法配制;去離子水用美國Millipore公司制純水器生產.
     
　　1.2 方法  高壓修復參照Norton等［10］ 方法:1.5L修復液入壓力鍋中，加熱至沸騰.將脫蠟至水切片置于金屬架上，浸入鍋內修復液中，蓋壓力鍋閥，加熱至壓力鍋噴氣后1min，停止加熱，冷水浸至室溫.微波修復參照Cattoretti等［9］ 方法:將脫蠟至水切片放入盛有修復液的染缸中，置醫用微波爐內中低檔加熱10min，取出冷卻至室溫.煮沸修復法:將脫蠟至水切片浸入盛修復液的燒杯中，燒杯置于盛有自來水的鋁鍋內，電爐上加熱，燒杯中溫度達97℃后開始計時，15min后停止加熱，冷至室溫.
     
　　1.3 免疫組化檢測及結果判斷  BCL-6mAb購自英國Novocastra公司，工作濃度1∶20.EnVisionTM 及催化信號擴增（catalyzed signal amplification，CSA）免疫組化試劑盒購自Dako公司，按說明操作.11份標本各切片13張，分13組.其中一組不修復，用CSA試劑盒檢測.另12組用不同的修復液及修復方法修復，運用Dako EnVisionTM 兩步法檢測.TBS替代一抗作陰性對照.陽性強度評價采用半定量方法，陰性不著色（-），淡黃色為陽性（+），棕黃色顆�；驁F塊為強陽性（）（著色部位位于胞核）.
    
　　統計學處理:實驗結果采用χ2 檢驗.
     
　　2 結果
     
　　2.1 未經修復組檢測結果  用CSA試劑盒檢測未修復組，抗BCL-6免疫組化染色均為陰性（Fig1）. 2.2 不同方法修復后BCL┐6檢測結果  經EDTA、檸檬酸、碳酸鈉及去離子水4種修復液，分別用高壓、微波及煮沸3種修復方法處理后，EDTA組陽性率顯著高于檸檬酸組（P<0.01），后者又高于碳酸鈉組 和去離子水組（P<0.01）.3種修復方法比較，高壓修復陽性率高于微波修復組（P<0.05）和煮沸組（P<0.01）.且高壓修復無組織脫片現象，其他修復方法均有不同程度的脫片（Tab1）.圖1 － 圖2 略
　　表1 不同方法修復后BCL-6檢測結果　略
         
　　2.3 高壓配合不同修復液的修復效果  EDTA或檸檬酸結合高壓修復方法，檢出BCL-6陽性率分別為100%和81%（P>0.05），顯著高于碳酸鈉組及去離子水組（Tab2，P<0.01）.EDTA組11例陽性中有9例為強陽性表達（Fig2），高于其他各組（P<0.01，Tab2）.
     
　　3 討論
     
　　用靈敏度50余倍標準LSAB（labeled strepta-vidin biotin）的CSA試劑盒（見說明書）檢測未經修復的11例石蠟切片，結果全為陰性，提示100g・L-1 甲醛固定后的石蠟切片中BCL-6抗原活性基本丟失.較多研究認為石蠟切片不能較好地顯示抗原的原因，不是抗原破壞，而是抗原受到遮蔽.不同抗原遮蔽的主要原因亦不相同，因此所用的修復液和修復方法也應有所不同［9］ .Morgan等［8］ 推測引起抗原遮蔽的主要原因有:①40g・L
-1 甲醛固定過程中產生的甲酸可與某些蛋白質位點發生十字交聯形成亞甲基橋.高溫下這種亞甲基橋可在水溶液中水解，抗原活性重新暴露.②一些蛋白質在40g・L-1 甲醛固定和高溫浸蠟過程中，其三級結構發生改變，使原本暴露的抗原隱藏起來.③某些蛋白質在40g・L-1 甲醛固定時產生大量羥基、羧基及磷�；�基團，這些基團易與動物組織中豐富的鈣離子緊密結合形成復合物，引起抗原遮蔽.
     
　　表2 不同修復液結合高壓修復后檢出BCL-6的陽性狀況　略
           
　　用BCL-6mAb檢測經修復后淋巴組織石蠟切片中BCL-6抗原表達情況，國外雖有報道，但所用修復液及修復方法各不相同［11，12］ ，目前尚未見探討40g・L-1 甲醛固定后BCL-6抗原失活機制及理想修復方法的報道.我們用微波、高壓、煮沸3種常用修復方法對4種修復機制不同的修復液的修復效果進行了比較，發現EDTA溶液對40g・L-1 甲醛固定后的BCL-6抗原活性修復能力最強，其次為檸檬酸溶液，碳酸鈉鹽只有較弱的修復作用，去離子水沒有修復作用.EDTA和檸檬酸均為鈣離子強螯合劑.碳酸鈉鹽亦有鈣離子沉淀作用.而去離子水無結合鈣離子作用.以上結果表明，經40g・L-1 甲醛固定后石蠟切片中BCL-6抗原失活的主要機制可能與鈣離子復合物形成有關.對4種不同的修復液結合3種常用修復方法的修復效果進行檢驗表明，高壓修復效果最好，可能在高壓狀態下鈣離子與蛋白質抗原形成的復合物更易解離.對4種修復液結合高壓修復的效果進行驗證，發現差異懸殊.EDTA溶液結合高壓修復法修復BCL-6抗原后，其檢出陽性率及陽性強度均高于其他各組，是修復石蠟切片中BCL-6抗原活性 的最隹方法.此法經濟方便，操作簡單，為進一步研究BCL-6抗原失活及修復機制，以及研究其表達意義打下了良好基礎. 
　　參考文獻:
     
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