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醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專(zhuān)業(yè)的畢業(yè)論文
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摘要：基于石墨烯量子點(diǎn)( GQDs) 的熒光性能建立了一種非標(biāo)記熒光方法，用于靈敏和選擇性測(cè)定抗壞血酸( AA) .GQDs 溶液在紫外光激發(fā)下發(fā)出很強(qiáng)的藍(lán)色熒光，當(dāng)向溶液中加入 AA 后，GQDs 溶液的熒光被猝滅。猝滅機(jī)理可能為在弱酸性介質(zhì)中，AA 與 GQDs 發(fā)生氧化還原反應(yīng)，AA 轉(zhuǎn)移電子給 GQDs.熒光猝滅強(qiáng)度與AA 濃度在 5.0 × 10- 6~ 7.5 × 10- 5mol / L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限低至 1.0 × 10- 6mol / L.該體系成本低、操作簡(jiǎn)單，并且在多種可能干擾的物質(zhì)存在下對(duì) AA 表現(xiàn)出很高的選擇性。本方法應(yīng)用于生物樣品中AA 的檢測(cè)，回收率在 95.2% ~ 115.3% 之間。
關(guān)鍵詞： 石墨烯量子點(diǎn); 熒光探針; 非標(biāo)記方法; 抗壞血酸。
Abstract: A label-free fluorescence method based on the fluorescence property of graphene quantumdots ( GQDs) was developed for sensitive and selective detection of ascorbic acid ( AA) .The initialstrong blue fluorescence of the GQDs in aqueous solution was effectively quenched upon addition ofAA.The quenching mechanism may involve transfer of electrons from AA to GQDs via the redox re-action of AA and GQDs in weak acid solution.The quenching efficiency was linearly proportional tothe concentration of AA within the range of 5.0 × 10- 6- 7.5 × 10- 5mol / L with a low detection limitdown to 1.0 × 10- 6mol / L.The proposed sensing system is simple and low-cost with facile experi-mental operations,and has a high selectivity for AA over a number of possible interfering species.Additionally,this method was successfully applied to the determination of AA in biological sampleswith satisfactory recoveries ( 95.2% - 115.3% ) .
Key words: graphene quantum dots; fluorescence probe; label-free method ; ascorbic acid.
1、引言。
石墨烯量子點(diǎn)( GQDs) 是最近發(fā)現(xiàn)的粒徑小于 100 nm 具有0 維結(jié)構(gòu)的石墨烯納米片[1-3].與石墨烯類(lèi)似，GQDs 也有大的表面積和 π-π 共軛網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。作為一種新的碳納米熒光材料，GQDs由于其優(yōu)越的光穩(wěn)定性、優(yōu)良的光學(xué)和電化學(xué)性能、高的熒光活性、抗光漂白能力和低細(xì)胞毒性[4-8],已經(jīng)在化學(xué)、材料、物理學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域引起較大關(guān)注并成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一，目前已用于氯離子[9]、磷酸[10]、三磷酸腺苷[11]、三價(jià)鐵離子[12]、過(guò)氧化氫[13]、葡萄糖[14-15]、免疫球蛋白 G[16]、生物巰基化合物[17-18]、脫氧核糖核酸[19]和胰蛋白酶[120]的檢測(cè)，以及用于藥物釋放[21]和生物成像[22-24]等領(lǐng)域。
抗壞血酸( AA) 是一種重要的抗氧化劑，在人體平衡氧化壓力中起重要作用。AA 在人體液中存在的濃度相對(duì)較高，例如，人血液中 AA 的濃度為 6 ~ 15 μg/mL[25].AA 是治療壞血病、藥物中毒、肝臟疾病、過(guò)敏反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化的藥物，并能幫助促進(jìn)健康細(xì)胞的發(fā)展、鈣的吸收和正常組織的生長(zhǎng)。在制造果汁和飲料時(shí)，AA 也作為一種抗氧化劑使用。因此，AA 的檢測(cè)對(duì)制藥、臨床和食品工業(yè)均具有重要意義[26].目前檢測(cè)AA 的方法主要有電化學(xué)方法[27]、化學(xué)發(fā)光法[28]、高效液相色譜法[29]、分光光度法[30]、毛細(xì)管電泳法[31]和熒光分析法[32]等。電化學(xué)方法由于靈敏度高，是檢測(cè) AA 的主要方法。但是，與AA 具有相似還原性質(zhì)的分子如尿酸( UA) 和多巴胺( DA) 對(duì)該方法造成的干擾較大，而且 AA 的氧化產(chǎn)物會(huì)吸附在電極表面，影響體系的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。熒光分析法具有簡(jiǎn)單、方便和快速等優(yōu)點(diǎn)。因此，本工作以 GQDs 作為熒光探針，建立了基于 GQDs 的熒光猝滅檢測(cè) AA 的新方法。
2、實(shí)驗(yàn)。
2.1 儀器與試劑。
LS-55 型發(fā)光光度計(jì)( Perkin-Elmer,USA) ; Cary60 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)( Agilent Technologies,USA) ; PHSJ-4A 型 pH 計(jì)( 上海精密科學(xué)儀器有限公司) ; XW-80A 型漩渦振蕩混合器( 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠) ; TGL-16G-A 型高速冷凍離心機(jī)( 上海安亭科學(xué)儀器廠) 等; SZCL-3B 數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器( 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司) ;78-1 磁力加熱攪拌器( 常州國(guó)華電器有限公司) ; BS 110S 電子天平( 北京賽多利斯天平有限公司) ; FL3-P-TCSPC 時(shí)間分辨熒光儀( HORIBA JOBIN JVON,France) ; JEM-2100F 場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡( JEOL) ; Multimode 8原子力顯微鏡( Bruker,USA) .
抗壞血酸( AA) 、人血清白蛋白( HSA) 購(gòu)于美國(guó) Sigma-Aldrich 公司; 多巴胺( DA) 購(gòu)于 AlfaAesar 公司; D-色氨酸 ( D-Trp) 、DL-蘇氨酸 ( DL-Thr) 、L-α-丙氨酸 ( L-α-Ala) 、L-組氨酸 ( L-His) 、D-絲氨酸 ( D-Ser) 、L-賴氨酸 ( L-Lys) 、L-亮氨酸( L-Leu) 、L-苯丙氨酸( L-Phe) 由中國(guó)醫(yī)藥( 集團(tuán))上�；瘜W(xué)試劑公司提供; 尿酸( UA) 購(gòu)于上海生工生物有限公司; 半乳糖( Gal) 、果糖( Fru) 、甘露糖( Man) 購(gòu)于比利時(shí) Acros Organics 公司; 檸檬酸購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠。
實(shí)驗(yàn)所用其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為 18.2 MΩ·cm 的超純水。
實(shí)驗(yàn)所用的緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液( 1.0 ×10- 2mol / L,pH 4.0 ~ 7.5) : 稱(chēng)取 0.78 g NaH2PO4·2H2O,溶于 450 mL 超純水中，定容至 500 mL,用H3PO4和 NaOH 溶液調(diào)節(jié) pH 值。
2.2 人血清樣品的預(yù)處理。
人血清樣品取自桂林市第五人民醫(yī)院。取200 μL 人血清，置于 1.5 mL 離心管中，加入 400μL 乙腈，漩渦震蕩混合 5 min,在高速冷凍離心機(jī)上以 1.2 ×104r / min 的速度離心 20 min,取上層清液，用氮?dú)獯蹈�，殘留物�?1 000 μL 超純水溶解，試液置于冰箱中 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.3 GQDs 的合成。
GQDs 的合成方法參照文獻(xiàn)[33].稱(chēng)取 2.0g 檸檬酸加入試管中，加熱至 200 ℃ ,當(dāng)檸檬酸全部融化后開(kāi)始計(jì)時(shí)。20 min 后，溶液顏色變?yōu)殚偌t色。在磁力攪拌作用下，將橘紅色液體用滴管逐滴加入 100 mL 含 10 mg NaOH 的溶液中，用HCl 調(diào)節(jié) pH 至 7.0,得到 GQDs 水溶液，濃度為14 mg / mL,于 4 ℃ 下避光保存。
2.4 實(shí)驗(yàn)方法。
在一系列0.6 mL 的離心管中，依次加入10 μL1.4 mg / mL GQDs、10 μL 不同濃度的 AA 以及 80 μLpH =4.5 的磷酸鹽緩沖液，充分混勻后，在 37 ℃ 下孵育4 h.冷卻后，采用 LS-55 型發(fā)光光度計(jì)( Per-kin-Elmer,USA) 記錄樣品在 453 nm 處的熒光強(qiáng)度，設(shè)置電壓為750 V,激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度均為15 nm,掃描速度為1 000 nm/min,激發(fā)波長(zhǎng)為367 nm.
3、結(jié)果與討論。
3.1 GQDs 的表征。
所合成的 GQDs 的透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡圖像、紅外光譜、紫外吸收光譜和熒光光譜均參見(jiàn)文獻(xiàn)[34].本實(shí)驗(yàn)合成的 GQDs 的粒徑為17 ~21nm,平均厚度為 1.5 nm.GQDs 表面存在羧基和羥基，這些官能團(tuán)賦予了 GQDs 優(yōu)良的水溶性。GQDs在紫外區(qū)有較強(qiáng)的吸收，在 360 nm 處有一吸收峰，并且在 365 nm 紫外燈照射下可觀察到藍(lán)色熒光。GQDs 具有對(duì)稱(chēng)的激發(fā)和發(fā)射光譜，其最大激發(fā)波長(zhǎng)為367 nm,最大發(fā)射峰波長(zhǎng)為453 nm.
3.2 熒光猝滅機(jī)理。
GQDs 的熒光猝滅機(jī)理。GQDs本身在激發(fā)光照射下發(fā)出藍(lán)色熒光。已有研究證明，氧化石墨烯( Graphene oxide,GO) 能被 AA 還原[35].因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)合成的 GQDs 表面帶有-COOH,與 GO 具有相似的表面基團(tuán)，因此加入 AA后，AA 與 GQDs 發(fā)生氧化還原反應(yīng)，AA 被氧化為脫氫 抗 壞 血 酸 ( dehydro-AA) 并 轉(zhuǎn) 移 電 子 給GQDs,GQDs 的熒光被猝滅。
3.2.1 紫外吸收光譜。
猝滅機(jī)理也可通過(guò)紫外光譜來(lái)證明。加入 AA 后，GQDs 在 360 nm 處的特征峰消失，說(shuō)明 GQDs 與 AA 反應(yīng)生成了其他物質(zhì)。
3.2.2 熒光壽命。
為了進(jìn)一步證實(shí) AA 對(duì) GQDs 的猝滅機(jī)理，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了體系的熒光壽命是 AA 加入前后 GQDs 的熒光衰減曲線。
表 1 是 GQDs 猝滅前后的熒光壽命值。從表中可以看到，AA 加入前后，體系的熒光壽命發(fā)生了明顯變化，說(shuō)明猝滅過(guò)程是動(dòng)態(tài)猝滅[36-37].動(dòng)態(tài)猝滅是碰撞過(guò)程，因此 AA 猝滅 GQDs 的熒光機(jī)理可解釋如下：
GQDs + h ν →* GQDs + AA→[* GQDs…AA]( 碰撞復(fù)合物 )→GQDs-+ AA+( 還原態(tài)的電子轉(zhuǎn)移)[38]
激發(fā)態(tài)分子* GQDs 遇到AA,兩者相互作用導(dǎo)致電子和能量的轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致* GQDs 的熒光猝滅。
3.3 可行性驗(yàn)證。
為了考察本方案的可行性，我們對(duì) GQDs 與AA 反應(yīng)前后的樣品溶液進(jìn)行了熒光光譜掃描。AA 加入后，GQDs 在 453 nm 的熒光強(qiáng)度降低，熒光被猝滅了 79.6%,說(shuō)明該方法能用于 AA 的檢測(cè)。
3.4 AA 與 GQDs 作用時(shí)間的優(yōu)化。
實(shí)驗(yàn)考察了 AA 加入后，GQDs 溶液的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。見(jiàn)，體系的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，在大約4h 以后，熒光強(qiáng)度降低速度減慢，之后熒光強(qiáng)度變化不大。為了保證測(cè)定的靈敏度同時(shí)縮短分析時(shí)間，實(shí)驗(yàn)選擇4 h 作為 AA 與 GQDs 的作用時(shí)間。
3.5 pH 值的優(yōu)化。
實(shí)驗(yàn)以磷酸鹽為緩沖液，考察其 pH 值對(duì) AA猝滅 GQDs 熒光的影響，結(jié)果。GQDs本身的熒光會(huì)受 pH 的影響。當(dāng) pH 在 4.0 ~7.5之間時(shí)，GQDs 的熒光隨 pH 的升高而增強(qiáng)，但體系在 pH =4.5 時(shí)有最高的信噪比。因此，實(shí)驗(yàn)選擇 pH =4.5 的磷酸鹽緩沖液作為 AA 與 GQDs 的反應(yīng)緩沖液。
3.6 線性范圍和檢出限。
在上述優(yōu)化的條件下，實(shí)驗(yàn)對(duì)一系列不同濃度的 AA 進(jìn)行了檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果�？梢钥闯�，隨著 AA 濃度的增大，體系在 453nm 處的熒光強(qiáng)度逐漸降低，并且熒光強(qiáng)度值的比值 F0/ F( F0為 GQDs 的熒光強(qiáng)度，F(xiàn) 為加入 AA之后體系的熒光強(qiáng)度) 與 AA 的濃度在5.0 ×10- 6~7.5 × 10- 5mol / L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為 F0/ F = 0.0537C + 0.7467,R =0.997 1( C 為 AA 的濃度，單位 10- 6mol / L) ,檢測(cè)限( 3σ，σ = S0/ S,S0為空白溶液多次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率) 為 1.0 ×10- 6mol / L.我們將本方法與其他檢測(cè) AA 的方法做了對(duì)比，見(jiàn)表 2.從表 2 中可以看出，該方法與其他方法相比具有較高的靈敏度。
為了考察該方法的精密度，實(shí)驗(yàn)將 7.5 ×10- 5mol / L AA 與 GQDs 反應(yīng)進(jìn)行了 11 次平行測(cè)定，得到熒光強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 ( RSD) 為3.4% .3.7 特異性考察。
為了考察所建立方法的特異性，實(shí)驗(yàn)選用幾種糖類(lèi)以及 HSA、尿素( Urea) 和幾種氨基酸作為對(duì)照樣品進(jìn)行分析。GQDs 的濃度為 0.14 mg/mL,AA 的濃度為 7.5 × 10- 5mol / L,其他作為干擾物質(zhì)的濃度均為 7.5 × 10- 5mol / L.實(shí)驗(yàn)結(jié)果�？梢钥闯觯挥� AA 的加入能引起信號(hào)的明顯變化，其他物質(zhì)均不存在干擾，特別是 DA、UA 這兩種與 AA 有相似電化學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)，也不存在干擾。因?yàn)樵诒緦?shí)驗(yàn)中，AA 與GQDs 的反應(yīng)介質(zhì)為 pH = 4.5 的磷酸鹽緩沖液，在這個(gè) pH 值下，DA、UA 均不干擾 AA 的測(cè)定。
3.8 實(shí)際樣品分析。
為了考察本研究所建立的方法是否可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)對(duì)人血清樣品進(jìn)行了分析。從醫(yī)院取的血清樣品按照 2.2 節(jié)方法進(jìn)行處理，在稀釋 50 倍后的血清中進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 3 所示。從表中可以看到，人血清中 AA 的加標(biāo)回收率在 95.2% ~115.3%范圍內(nèi)。
4、結(jié)論。
建立了一種基于 GQDs 熒光猝滅檢測(cè) AA的新方法，該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，檢出限低至 1.0 ×10- 6mol / L,特異性強(qiáng)，一些糖類(lèi)和氨基酸的存在均不干擾 AA 的測(cè)定，甚至是與 AA有相似電化學(xué)性質(zhì)的 DA、UA 的存在對(duì) AA 的檢測(cè)也沒(méi)有影響。本實(shí)驗(yàn)用到的所有原料都價(jià)廉易得且不需要任何修飾過(guò)程，GQDs 相對(duì)于其他量子點(diǎn)的合成更簡(jiǎn)單而且具有低毒性，有望應(yīng)用于生物體內(nèi)生物活性物質(zhì)的檢測(cè)。
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