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新型潛在肝損傷生物標志物探究
藥物性肝損傷是指由藥物本身及其代謝產物或由于特殊體質對藥物的超敏感性或耐受性降低所導致的肝臟功能異常或肝臟損傷，下面是小編搜集的一篇關于新型潛在肝損傷生物標志物探究，歡迎閱讀借鑒。
越來越多的研究表明藥物性肝損傷(drug-inducedliverinjury,DILI)是急性或/和慢性肝臟疾病的重要誘因之一，在西方國家藥物性肝損傷是導致急性肝衰竭的首要因素;也是導致新藥申報未能獲批、經FDA批準上市藥物最終撤市(如曲格列酮、曲伐沙星等)最普遍的原因之一。雖然DILI的發生率相對較低，約為1/10000至1/100000[1],但在DILI患者群中出現急性肝衰竭的風險和死亡率相對較高，相關數據表明由DILI引發最終需接受肝移植或導致死亡的人數約占10%[2,3].另外，由于相關研究方法的限制，在藥物開發的臨床前研究及傳統臨床病理檢測中約有40%具有潛在肝毒性的化合物未能篩查出[4].因此，DILI不容小覷。
DILI是一類復雜的疾病，指由藥物本身或/及其代謝產物或由于特殊體質對藥物的超敏感性或耐受性降低所導致的肝臟功能異常或肝臟損傷。根據其病理特征分為肝細胞型肝損傷、膽汁淤積型肝損傷及混合型肝損傷。用藥人群對肝毒性藥物的機體反應可分為3個層次，即適應、耐受和損傷發生[1].藥物在批準上市前都需通過安全性評價檢測，因此對大多數人來說，治療劑量的藥物發生肝損傷風險很小，只有在某些肝毒性藥物(如對乙酰氨基酚)攝入過量、超過機體耐受能力時才會發生藥物劑量依賴性肝損傷。
而對于DILI易感人群，某些藥物在治療劑量下就可能引發特異質型肝損傷。這類肝損傷在新藥開發前期研究中不易發現，與用藥劑量無關，并且在臨床用藥時采用常規肝損傷指標難以預測。因此，尋找能預測特異質型肝損傷的發生、識別易感人群的理想生物標志物是當前研究的熱點和難點。
DILI初發癥狀一般特異性不高，大多與其他非藥源性肝臟疾病類似，同時其體征還具有一定的隱匿性，部分患者在發生DILI早期表現出輕微肝臟生化指標異常甚至正常。因此，臨床上采用現行的檢測指標難以對DILI及早診斷、明確病理類型，由此不利于進行針對性地干預或及時停藥。雖然大部分輕微的肝損傷癥狀在停藥后可自行緩解，但一旦錯過最佳診療時機，發生不可逆嚴重肝損傷，預后情況則不佳。另外，具有肝毒性的藥物其種類、結構多樣，有研究表明單從藥物分子理化特性的角度不能找到有助于篩查藥物肝毒性信息[5,6].同時DILI分子機制的復雜性也增大了其檢測診斷難度。DILI的致病機制包括：藥物毒性代謝產物的生成、親電性化合物或活性氧引發氧化應激和線粒體功能紊亂、藥物分子作為半抗原結合細胞蛋白，干擾細胞蛋白分子的正常生理功能或激活免疫系統引發特異質藥物性肝損傷等。
總之，目前臨床上運用傳統的肝損傷指標來預測、診斷DILI的能力極為有限。為了能有效預測、及時診斷和治療DILI,尋找能在藥物開發和臨床相關性肝損傷發生發展早期能特異性評估發病風險的生物標志物是亟待解決的問題。
1傳統肝損傷生物標志物
Hy's法則是目前臨床上診斷DILI的金標準。包括丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素和總膽汁酸等在內的傳統指標已被廣泛應用于臨床多年，這些指標在對嚴重DILI的診斷方面具有重要的地位，但對于肝損傷的早期診斷、易感人群的識別區分等方面具有一定的局限性。
ALT、AST主要分布于肝細胞內，肝細胞出現損傷或壞死時，肝細胞完整性被破壞，ALT、AST被釋放入血，由此引起血漿中相應含量上升，因此血漿中ALT、AST的升高反映了肝細胞膜破壞程度。血漿中ALP、γ-谷氨酰轉肽酶的含量通常用作膽汁淤積的診斷指標，其異常升高直接反映了肝膽管膜的損害。總膽紅素和總膽汁酸在循環血中的濃度取決于代謝酶的誘導作用和肝細胞內生物合成活性，因此總膽紅素和總膽汁酸反映了肝功能的狀態，并非肝損傷的發生程度[7].因此，這些指標實質是根據肝細胞膜的完整性和肝功能異常來間接反映肝損傷，適用于在肝損傷發生之后對其進行診斷檢測，而對肝損傷發生早期的預測較差。同時，部分傳統指標在肝損傷診斷方面所具有的特異性不強。因為骨骼肌損傷也會導致血漿ALT、AST的增高[8],某些不涉及臨床相關肝損傷的藥物(如雙氯芬酸鈉)也有可能發生ALT一過性升高[9],另外肝臟具有一定的膽紅素清除潴留效應，也有可能引起血漿膽紅素非病理性變化[7].
2新型潛在肝損傷生物標志物
2.1血液樣本中的生物標記
肝功能相關生化指標檢測是目前臨床上用來診斷DILI最為有效的手段。
2.1.1蛋白質分子當前蛋白質組學在生物標志物的篩選方面應用較多。Amacher等[10]利用蛋白質組學技術在大鼠模型上將蘋果酸脫氫酶(MDH)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、對氧磷酶(PON1)篩選作為與肝毒性相關的血清生物標志物。Schomaker等[11]為檢驗MDH、PNP、PON1、谷氨酸脫氫酶(GLDH)能否作為人體肝損傷指標進而開展臨床隊列研究。研究結果表明GLDH、MDH與ALT升高的水平具有高度相關性，并且不受年齡和性別因素的影響，對于肝損傷具有較高的預測效力，同時也具有良好的診斷價值。Antoine等[12]
選取對乙酰氨基酚導致肝損傷的首診患者進行臨床研究，最終結果表明，相比于ALT,高遷移率族蛋白1(HMGB1)、凋亡型角蛋白18(K18)能及時靈敏地診斷對乙酰氨基酚過量引起的肝損傷。
另外，Bailey等[13]進行的大鼠實驗結果提示α-谷胱甘肽巰基轉移酶(α-GSTA)、精氨酸酶1(ARG1)、4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HDP)用以監測DILI具有比ALT更高的特異性和靈敏性，其中ARG1作為檢測指標能提高對膽管損傷的檢測靈敏度，α-GSTA與ALT結合可以更靈敏地檢測肝細胞空泡樣變性的病理變化，HDP協同ALT用于診斷肝腫大具有更高的特異性。2012年，Bell等[14]運用蛋白質組學技術對DILI前瞻性研究機構收集的相關人群血樣展開了一項系統性研究，發現不少蛋白質分子可以在一定程度上表征DILI發生與否、發生程度、病理類型及預后狀態等。如DILI患者與健康人體內apolipoproteinE水平有顯著性差異，fumarylacetoacetase可以用來鑒別肝細胞型DILI與混合型DILI等。
由此看來，這些蛋白質分子作為生物標志物都具有較大的潛力，但考慮到藥物肝毒性機制的復雜性，關于這類分子所具有的潛在臨床價值是否具有普適性還是僅適用于某種特定的肝毒性藥物等方面仍不明確，還需開展更加深入的研究。
2.1.2循環RNA循環血中含有的部分RNA來源于某些組織中細胞的裂解或壞死，具有一定的組織特異性。這些循環RNA大多與血中蛋白結合形成微囊或外泌體，避免了核糖核酸酶的降解作用，因此能比較穩定地分布于血液中。Wang等[15]采用小鼠對乙酰氨基酚肝損傷模型對循環miRNA進行了DILI方面的研究，發現miR-122、miR-192與肝損傷的發生密切相關。其中miR-122是一種具有較高肝臟特異性的miRNA,其在肝臟中的分布豐度約占體內總含量的70%[16].隨后，Starkey等[17]對此開展了相應的臨床試驗，研究結果表明在miR-122、miR-192同樣適用于檢測人體對乙酰氨基酚肝損傷，并且miR-122在檢測靈敏性和特異性上更加優于ALT.這一結論隨后在一項對乙酰氨基酚肝損傷首診患者的臨床研究[12]中再次得到證實。
外周血中也同樣存在著具有肝臟特異性的mRNA,Kudo等[18]研究發現通過檢測白蛋白Alb和結合珠蛋白haptoglobin的mRNA水平能更加靈敏地檢測肝臟纖維化的發生與發展。Wetmore等[19]證實在肝毒性藥物干預過程中，相關肝臟特異性mRNA的改變發生在血清轉氨酶和肝臟組織病理出現變化之前。
目前肝臟特異性mRNA的相關研究都是建立在大鼠等動物模型上，后續還需足夠樣本量的臨床試驗來對其臨床價值予以佐證。
2.1.3內源性物質(膽汁酸和脂肪酸)譜血漿或血清中的總膽汁酸水平可以表征肝臟排泄功能，現已作為檢測肝損傷的指標之一應用于臨床。近幾年相關文獻[20?23]報道體液中膽汁酸譜，即結合型膽汁酸含量、游離型膽汁酸含量或其相對比例的變化與肝損傷的發生有密切聯系。本課題組在前期研究[24]中發現，在抗結核藥物所致肝損傷引起血漿生化指標和肝臟病理顯著改變之前，相關膽汁酸轉運體表達水平和活性已出現一定的改變。Yamazaki等[20]將多種肝毒性藥物作用于大鼠模型，發現在肝毒性藥物低劑量作用早期，在血清轉氨酶還未出現明顯改變的情況下，體液中的膽汁酸含量已顯著上升，并且隨著發生的肝毒性病理種類不同，其膽汁酸譜的變化也呈現出一定的差異，由此表明機體內膽汁酸穩態的破壞是發生DILI的早期事件之一。Ellinger-Ziegelbauer等[21]
研究指出大鼠模型體液中游離型膽汁酸的升高可指示為肝細胞型肝損傷，結合型膽汁酸的升高大多表明肝膽管損傷。若這一結論能在臨床試驗方面得到進一步的證實，膽汁酸譜將能作為具有肝損傷病理類型區分特性的生物標志物。同時，某些膽汁酸還有可能作為肝損傷預后判斷的生物標志物。Woolbright等[25]研究發現甘氨脫氧膽酸作為對乙酰氨基酚所致急性肝衰竭的預后指標其評估效能較高，提示可用于預測進展為急性肝衰竭患者的存活率。另外，體內脂肪酸譜與DILI之間也存在著一定的聯系。有文獻[26]報道在伏立康唑用藥人群中，相比于未出現肝損傷的患者，發生肝損傷患者其血漿中脂肪酸含量發生了一系列變化。在檢測的12種脂肪酸中，發現有10種其含量都出現明顯增加，其中C14∶0、C16∶1t、C18∶3t、C20∶2、C20∶4這5種脂肪酸含量改變尤為顯著。由此，機體內脂肪酸譜的相應變化將有可能表征伏立康唑所致肝損傷的發生。
2.1.4相關基因型或基因多態性從根本上避免DILI,尤其是特異質型肝損傷，最理想的情況是在用藥人群接觸具有潛在肝毒性藥物之前就能及時辨別DILI易感人群，從而對其選用其他安全性高的藥物。
個體化醫學強調，個體攜帶的某些特定基因在一定程度上已經決定了相關藥物或化合物的代謝途徑及程度。因此不少研究團體借助藥物基因組學技術試圖在該領域尋找具有良好預測價值的理想生物標志物。目前已發現一些與DILI易感性高度相關的特定基因。
先后有幾項研究[27?29]表明，除了年齡、營養狀態、性別、合并用藥等獨立風險因素外，具有282T/T、590A/A、857G/A或857A/A;NAT2*5B/5B或NAT2*6A/6A;GSTT1基因缺失純合子基因型的個體很有可能為抗結核藥物肝損傷的高風險人群，其中NAT2慢乙酰化基因型可能是異煙肼引起DILI的主要風險因素。抗生素類藥物雖然常被用以短期給藥，但也出現了肝損傷的相關病例。研究[30?32]
發現分別篩查HLA-B*5701與HLAclassIISNPrs9274407基因型可以在一定程度上幫助識別氟氯西林、阿莫西林克拉維酸肝損傷易感人群。另外，膽酸鹽外排泵BSEP功能障礙易導致肝內膽汁淤積，繼而引發肝損傷。Lang等[33]研究發現攜帶突變型BSEP基因的個體發生膽汁淤積型肝損傷的風險明顯增大，如BSEP676位點由天冬氨酸突變為酪氨酸，與氟伐他汀鈉導致的肝損傷顯著相關，BSEP855位點由甘氨酸突變為精氨酸，與雌二醇引發的肝損傷高度相關。
截至目前，絕大部分研究都是選取血液樣本來尋找理想生物標志物。從血液樣本中發現的相關潛在標志分子越來越多，研究手段和建立的檢測方法也日趨成熟，但發現與確定能應用于臨床的新生物標志物仍然面臨不少問題。血液樣本的采集必須由醫護人員協助，采樣的次數、時間及采樣量受到一定的限制，同時也存在著來自醫學倫理學的約束。其次，血液樣本中成分復雜，測定干擾因素多，研究所采用的相關組學分析或芯片技術成本較高。同時血樣中存在著多種降解轉化酶，在DILI發生早期，某些特異性和靈敏度高的指示分子發生酶解的可能性較大。更重要的一點是血液樣本量極為有限。若要增大研究結果的置信度，提高研究結果向臨床轉化的應用價值，最根本的方法即為擴大樣本量，開展前瞻性研究，而這一點目前受到多方面的限制。
2.2尿液樣本中的生物標記
近年來不少研究致力于從尿液中尋找特異性較好的肝損傷生物標記物。尿液中的成分及其含量與其在血液中的分布具有一定的相關性，相比于血液樣本，尿液中的蛋白豐度更低，樣品檢測的信噪比更小，因此更有利于標志物的檢測。更為重要的是尿樣檢測具有無創性，這些特性使得尿液中生物標志物具有較好的臨床價值。值得注意的是，尿液樣本的生成比血液樣本多一步腎臟的濾過排泄過程，因此在進行尿液樣本中生物標志物的研究過程中需將腎功能可能產生的影響考慮在內[7].
當前從尿液中發現潛在肝損傷生物標志物的研究比較有限，主要圍繞蛋白質分子展開。vanSwelm等[34]采用對乙酰氨基酚肝損傷小鼠模型對尿液樣本進行蛋白組學研究，結果發現尿樣中超氧化物歧化酶1(SOD1)、碳酸酐酶3(CA3)和鈣調蛋白(CaM)含量變化與對乙酰氨基酚所致肝損傷的發生高度相關。他們繼而收集對乙酰氨基酚中毒患者和健康人群尿樣對以上指標進行深入研究，結果顯示SOD1、CA3只有在對乙酰氨基酚中毒患者尿樣中才能檢測到，更為有趣的是，尿樣中CaM的濃度與肝損傷患者血漿中對乙酰氨基酚的藥物濃度高度相關(r=0.97;P<0.0001)，在ALT未出現明顯病理性升高的患者尿樣中CaM已呈現顯著性上升，由此CaM顯示出比ALT更高的靈敏度和預測效力。另外，該研究團體還以長期服用甲氨蝶呤治療銀屑病的人群為研究對象，發現服用高劑量藥物的人群容易發生肝纖維化，其尿液中神經鈣粘素N-cadherin、結合珠蛋白haptoglobin和轉鐵蛋白serotransferrin等水平與甲氨蝶呤所致肝纖維化相關[35].
從尿液樣本中發現的肝損傷潛在生物標記分子已有部分進入臨床研究階段，但目前仍存在不少問題[7]限制了其向臨床應用方面的轉化。尿液中蛋白質的組成易受到飲食、運動、疾病等多個因素的影響，因此生物標志物候選分子必須具有足夠的特異性和穩定性來便于檢測。另外，尿量的波動范圍較大，水、鹽的攝入和流汗、腹瀉等都會引起尿量的改變，進而導致尿液中蛋白質分子濃度的變化，因此將相關分子濃度標準化是發揮這些特異性生物標志物應用價值的前提條件，因此制定尿液蛋白質分子濃度標準化指南是該領域尚需解決的問題。
3總結
近10年來，在DILI生物標志物研究領域已取得較大進展，表1整合了部分潛在生物標志物。理想的生物標志物應是在生物體受到嚴重損害之前，就能對嚴重毒性損傷提供早期警報，有助于從藥物代謝轉運、機體免疫和炎癥相關因素等多個方面綜合評估DILI的發生風險。傳統的肝損傷檢測指標未能滿足這些要求，同時，新藥開發前期藥物安全性評價體內體外研究模型與人體之間存在的差異以及尚未明確的特異質型肝損傷致病機制都提示研究者應盡快找到更為理想的生物標志物，降低DILI造成的危害，保障用藥安全。要想盡快達到這一目標，需要掌握更加充足的用藥信息，綜合臨床醫生提供的藥物不良反應報告、藥物臨床試驗所取得的相關信息、專業研究機構、網站和數據庫(如LiverTox)資源，由多領域專家(藥物學家、毒理學家、臨床醫生等)協同推進DILI研究，讓潛在生物標志物盡早服務于藥物開發與臨床。
References
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