研究外界條件的改變對(duì)紅花離體培養(yǎng)的影響

研究外界條件的改變對(duì)紅花離體培養(yǎng)的影響

摘要：目的研究外界培養(yǎng)條件的變化對(duì)紅花離體培養(yǎng)過程中不同發(fā)育階段培養(yǎng)物的影響。方法以紅花種子誘導(dǎo)的無菌苗子葉為外植體，分別接種至含有不同碳氮源、不同PH值、不同溫度、不同濕度和不同光照的培養(yǎng)基中，觀察其生長情況。結(jié)果通過實(shí)驗(yàn)篩選出蔗糖濃度為3%，KNO3濃度為MS培養(yǎng)基中KNO3濃度的2倍，最佳pH為6.2，紅花離體培養(yǎng)體系在24℃，30%的相對(duì)濕度，16 h光照，8 h黑暗交替培養(yǎng)的條件下，最利于紅花的分化。結(jié)論3%的蔗糖作為碳源，最適合愈傷組織的生長;2倍于MS培養(yǎng)基中的KNO3含量有利于愈傷組織的生長和不定芽的分化;pH值為6.2時(shí)，最適宜紅花不同階段培養(yǎng)物的生長;24℃為紅花離體培養(yǎng)的最適溫度，生根時(shí)的溫度為21℃較好;濕度為50%時(shí)，適于愈傷組織鮮重積累，30%的濕度適于不定芽分化和生根;黑暗培養(yǎng)利于鮮重積累，16 h光照，8 h黑暗交替培養(yǎng)有利于不定芽的分化，8 h光照，16 h黑暗交替培養(yǎng)有利于生根。

關(guān)鍵詞： 紅花愈傷組織; 不定芽; 蔗糖 ; 氮源; pH值; 溫度; 濕度; 光照

　　紅花為菊科一年或二年生雙子葉草本植物，喜溫暖、干燥氣候，抗寒性強(qiáng)，耐鹽堿。紅花全身是寶，花、籽粒、莖葉、秸稈等均可綜合利用，是一種集藥材、油料、染料為一體的特種經(jīng)濟(jì)作物[1]。由于紅花無性快繁體系很難建立，并且目前國內(nèi)對(duì)紅花離體培養(yǎng)的研究很少，因此本文通過改變不同的培養(yǎng)條件來研究紅花無性快繁體系的建立，以期有利于紅花的資源保護(hù)、擴(kuò)大繁殖和進(jìn)一步推廣應(yīng)用。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料紅花種子由新疆塔城種子公司提供; 實(shí)驗(yàn)以采收后1年后的紅花種子不同日齡無菌苗子葉作為外植體。
　　1.2 方法紅花種子，經(jīng)70%酒精清洗30 s， 0.1 %升汞表面滅菌10 min, 無菌水洗4～5次，接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基: 1/2MS 1.5%蔗糖 1 mg·L-1GA中，取接種7日齡的紅花無菌苗子葉作為外植體, 分別接種至含有不同碳氮源、不同pH值、不同溫度、不同濕度和不同光照的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和中;培養(yǎng)一段時(shí)間后，測(cè)定愈傷組織的鮮重增長量。
　　子葉完全愈傷化以后，將其轉(zhuǎn)入不同pH值的分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生。設(shè)置不同的溫度梯度和不同光照強(qiáng)度的條件，培養(yǎng)25 d后，觀察不定芽的形成情況，觀察分化情況，待不定芽形成以后，將其移至生根培養(yǎng)基中，每20 d繼代1次，觀察生根情況。
　　2 結(jié)果
　　2.1 碳源在紅花愈傷組織生長過程中的作用碳源既是重要的能源物質(zhì)，也是一種重要的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)植物離體形態(tài)發(fā)生起著非常重要的作用。而碳源的主要提供形式是糖類物質(zhì)，其中以蔗糖最為普遍，蔗糖是植物體內(nèi)糖類運(yùn)輸?shù)闹饕�形式，也是某些植物貯藏的主要化合物。有研究認(rèn)為，蔗糖的濃度對(duì)于組織培養(yǎng)很重要，適當(dāng)?shù)臐舛葘?duì)于維持培養(yǎng)基滲透勢(shì)，提高植物組培再生頻率具有重要意義。因此，本實(shí)驗(yàn)探討了不同的蔗糖濃度在紅花脫分化過程中起的作用，分別取1%～7%的蔗糖添加到培養(yǎng)基中，結(jié)果見圖1，以紅花愈傷組織鮮重增長量計(jì)算，培養(yǎng)基中加入的蔗糖含量在1%～3%范圍內(nèi)，鮮重增長量呈上升狀態(tài)，蔗糖含量在3%～7%范圍內(nèi)，紅花愈傷組織的鮮重增長量呈下降趨勢(shì)，蔗糖含量在3%時(shí)，愈傷組織鮮重增長量出現(xiàn)峰值，達(dá)到6.8 g，蔗糖含量低于3%時(shí)，在培養(yǎng)初期，鮮重增長迅速，培養(yǎng)后期，鮮重增長緩慢，以致收獲時(shí)，生物積累量不高，蔗糖含量高于3%時(shí)，鮮重增長量明顯下降，說明蔗糖含量過高，不利于細(xì)胞生物量的積累。
　　圖1 碳源對(duì)紅花愈傷組織生長的影響
　　2.2 氮源對(duì)紅花愈傷組織生長的影響培養(yǎng)基成分影響植物離體形態(tài)發(fā)生的效果，在植物組織培養(yǎng)過程中，KNO3和NH4NO3是兩個(gè)重要的氮素來源，其含量高低可影響愈傷組織生長、離體形態(tài)發(fā)生，且不同植物、不同的離體培養(yǎng)時(shí)期對(duì)KNO3和NH4NO3的需求亦不同。在紅花愈傷組織培養(yǎng)基中添加了不同濃度的KNO3和NH4NO3，觀察二者對(duì)紅花愈傷組織、不定芽和生根情況的影響。由表1可知，NO-3和NH4 均有利于細(xì)胞生長，當(dāng)MS培養(yǎng)基中去除NH4NO3，僅加入KNO3時(shí)，細(xì)胞生長緩慢，不定芽分化率極低，但分化出的不定芽伸長略有伸長;當(dāng)MS培養(yǎng)基中僅加入NH4NO3，去除KNO3時(shí)，細(xì)胞生長極其緩慢，對(duì)不定芽的分化及生根沒有促進(jìn)作用;在MS培養(yǎng)基中加入2倍KNO3時(shí)，細(xì)胞生長快速，比正常高出4.6%，不定芽分化效果較好，對(duì)不定芽伸長起到明顯的促進(jìn)作用，生根情況與正常接近;在MS培養(yǎng)基中加入2倍NH4NO3時(shí)，細(xì)胞生長一般，比正常低出6.2%，不定芽分化效果與正常MS接近，對(duì)不定芽伸長起抑制作用，生根情況與正常MS接近。因此說明，①細(xì)胞生長量的積累和不定芽的分化、伸長所需的氮源均不是單一形式的，既需要硝態(tài)氮又需要氨態(tài)氮，只有二者配合使用才能達(dá)到理想效果;② KNO3的含量加倍有利于細(xì)胞生長量的積累，同時(shí)還利于紅花不定芽的分化，對(duì)不定芽的伸長起到明顯的促進(jìn)作用;③NH4NO3的含量加倍，對(duì)不定芽的伸長起到抑制作用。表1 氮源對(duì)紅花愈傷組織生長的影響“-”表示無 ; “ ”表示生長緩慢 ; “ ”越多表示效果越好
　2.3 紅花培養(yǎng)物在不同酸堿性培養(yǎng)基中的生長情況基質(zhì)初始pH 值是植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)的主要影響因子，它直接影響培養(yǎng)物的生長、分化和物質(zhì)積累�；�質(zhì)最適初始pH值一般為5.0～6.0，但因植物培養(yǎng)的不同種類、不同部位及不同生理狀態(tài)而異。本實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)基的pH值設(shè)置5個(gè)梯度，分別為5.4，5.8，6.0，6.5，7.0觀察其對(duì)紅花培養(yǎng)物的影響。結(jié)果見表2，pH值的變化對(duì)愈傷組織的鮮重、不定芽的分化和生根均有一定影響。在一定范圍內(nèi)，鮮重增長量隨pH值的上升而上升，pH值為6.2時(shí)，達(dá)到峰值，之后又隨之下降。當(dāng)培養(yǎng)基偏酸性即pH值為5.4時(shí)，不定芽的分化率低，葉片為淺綠色、水分含量高;pH值為6.2時(shí)，不定芽分化數(shù)量相對(duì)較多，且葉片顏色深綠，水分含量少，抗逆性強(qiáng);當(dāng)培養(yǎng)基為中性即pH值為7.0時(shí)，不定芽分化極少，可能是由于中性環(huán)境的培養(yǎng)基過硬，不利于生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在胞內(nèi)的運(yùn)輸，以致愈傷組織難以吸收養(yǎng)分，難以分化形成不定芽。
　　2.4 溫度對(duì)紅花培養(yǎng)物的影響紅花分為春播和復(fù)播，春播紅花適宜期在4月上旬; 春播紅花在5月份處于出苗、分枝期,溫度較適宜。復(fù)播在6月左右，復(fù)播紅花7、8月處于苗期和花期生長階段, 出苗期間氣溫偏高，出苗速度加快，花期是紅花開花授精、籽粒開始形成的關(guān)鍵時(shí)期，故生長期間需要有較好的光熱及水肥條件,要求日平均氣溫保持在25～27℃。本實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)物分別置于18℃，21℃，24℃，27℃，30℃下培養(yǎng)，比較不同溫度對(duì)培養(yǎng)物的培養(yǎng)效果，結(jié)果見表3，24℃是愈傷組織培養(yǎng)的最佳溫度，24～27℃形成的不定芽狀態(tài)都較好，但21℃生根效果較好。這證明了較高的氣溫利于出苗。表2 pH值對(duì)紅花生長的影響“-”表示無 ; “ ”表示生長緩慢 ; “ ”越多表示效果越好
　　2.5 濕度對(duì)紅花培養(yǎng)物的影響紅花有強(qiáng)大的直根(根深達(dá)213 c

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