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研究外界條件的改變對紅花離體培養的影響
摘要：目的研究外界培養條件的變化對紅花離體培養過程中不同發育階段培養物的影響。方法以紅花種子誘導的無菌苗子葉為外植體，分別接種至含有不同碳氮源、不同PH值、不同溫度、不同濕度和不同光照的培養基中，觀察其生長情況。結果通過實驗篩選出蔗糖濃度為3%，KNO3濃度為MS培養基中KNO3濃度的2倍，最佳pH為6.2，紅花離體培養體系在24℃，30%的相對濕度，16 h光照，8 h黑暗交替培養的條件下，最利于紅花的分化。結論3%的蔗糖作為碳源，最適合愈傷組織的生長;2倍于MS培養基中的KNO3含量有利于愈傷組織的生長和不定芽的分化;pH值為6.2時，最適宜紅花不同階段培養物的生長;24℃為紅花離體培養的最適溫度，生根時的溫度為21℃較好;濕度為50%時，適于愈傷組織鮮重積累，30%的濕度適于不定芽分化和生根;黑暗培養利于鮮重積累，16 h光照，8 h黑暗交替培養有利于不定芽的分化，8 h光照，16 h黑暗交替培養有利于生根。
關鍵詞： 紅花愈傷組織; 不定芽; 蔗糖 ; 氮源; pH值; 溫度; 濕度; 光照
紅花為菊科一年或二年生雙子葉草本植物，喜溫暖、干燥氣候，抗寒性強，耐鹽堿。紅花全身是寶，花、籽粒、莖葉、秸稈等均可綜合利用，是一種集藥材、油料、染料為一體的特種經濟作物[1]。由于紅花無性快繁體系很難建立，并且目前國內對紅花離體培養的研究很少，因此本文通過改變不同的培養條件來研究紅花無性快繁體系的建立，以期有利于紅花的資源保護、擴大繁殖和進一步推廣應用。
1 材料與方法
1.1 材料紅花種子由新疆塔城種子公司提供; 實驗以采收后1年后的紅花種子不同日齡無菌苗子葉作為外植體。
1.2 方法紅花種子，經70%酒精清洗30 s， 0.1 %升汞表面滅菌10 min, 無菌水洗4～5次，接種到種子萌發培養基: 1/2MS 1.5%蔗糖 1 mg·L-1GA中，取接種7日齡的紅花無菌苗子葉作為外植體, 分別接種至含有不同碳氮源、不同pH值、不同溫度、不同濕度和不同光照的愈傷組織誘導培養基和中;培養一段時間后，測定愈傷組織的鮮重增長量。
子葉完全愈傷化以后，將其轉入不同pH值的分化培養基中，誘導不定芽的產生。設置不同的溫度梯度和不同光照強度的條件，培養25 d后，觀察不定芽的形成情況，觀察分化情況，待不定芽形成以后，將其移至生根培養基中，每20 d繼代1次，觀察生根情況。
2 結果
2.1 碳源在紅花愈傷組織生長過程中的作用碳源既是重要的能源物質，也是一種重要的滲透壓調節物質，對植物離體形態發生起著非常重要的作用。而碳源的主要提供形式是糖類物質，其中以蔗糖最為普遍，蔗糖是植物體內糖類運輸的主要形式，也是某些植物貯藏的主要化合物。有研究認為，蔗糖的濃度對于組織培養很重要，適當的濃度對于維持培養基滲透勢，提高植物組培再生頻率具有重要意義。因此，本實驗探討了不同的蔗糖濃度在紅花脫分化過程中起的作用，分別取1%～7%的蔗糖添加到培養基中，結果見圖1，以紅花愈傷組織鮮重增長量計算，培養基中加入的蔗糖含量在1%～3%范圍內，鮮重增長量呈上升狀態，蔗糖含量在3%～7%范圍內，紅花愈傷組織的鮮重增長量呈下降趨勢，蔗糖含量在3%時，愈傷組織鮮重增長量出現峰值，達到6.8 g，蔗糖含量低于3%時，在培養初期，鮮重增長迅速，培養后期，鮮重增長緩慢，以致收獲時，生物積累量不高，蔗糖含量高于3%時，鮮重增長量明顯下降，說明蔗糖含量過高，不利于細胞生物量的積累。
圖1 碳源對紅花愈傷組織生長的影響
2.2 氮源對紅花愈傷組織生長的影響培養基成分影響植物離體形態發生的效果，在植物組織培養過程中，KNO3和NH4NO3是兩個重要的氮素來源，其含量高低可影響愈傷組織生長、離體形態發生，且不同植物、不同的離體培養時期對KNO3和NH4NO3的需求亦不同。在紅花愈傷組織培養基中添加了不同濃度的KNO3和NH4NO3，觀察二者對紅花愈傷組織、不定芽和生根情況的影響。由表1可知，NO-3和NH4 均有利于細胞生長，當MS培養基中去除NH4NO3，僅加入KNO3時，細胞生長緩慢，不定芽分化率極低，但分化出的不定芽伸長略有伸長;當MS培養基中僅加入NH4NO3，去除KNO3時，細胞生長極其緩慢，對不定芽的分化及生根沒有促進作用;在MS培養基中加入2倍KNO3時，細胞生長快速，比正常高出4.6%，不定芽分化效果較好，對不定芽伸長起到明顯的促進作用，生根情況與正常接近;在MS培養基中加入2倍NH4NO3時，細胞生長一般，比正常低出6.2%，不定芽分化效果與正常MS接近，對不定芽伸長起抑制作用，生根情況與正常MS接近。因此說明，①細胞生長量的積累和不定芽的分化、伸長所需的氮源均不是單一形式的，既需要硝態氮又需要氨態氮，只有二者配合使用才能達到理想效果;② KNO3的含量加倍有利于細胞生長量的積累，同時還利于紅花不定芽的分化，對不定芽的伸長起到明顯的促進作用;③NH4NO3的含量加倍，對不定芽的伸長起到抑制作用。表1 氮源對紅花愈傷組織生長的影響“-”表示無 ; “ ”表示生長緩慢 ; “ ”越多表示效果越好
2.3 紅花培養物在不同酸堿性培養基中的生長情況基質初始pH 值是植物組織和細胞培養的主要影響因子，它直接影響培養物的生長、分化和物質積累。基質最適初始pH值一般為5.0～6.0，但因植物培養的不同種類、不同部位及不同生理狀態而異。本實驗將培養基的pH值設置5個梯度，分別為5.4，5.8，6.0，6.5，7.0觀察其對紅花培養物的影響。結果見表2，pH值的變化對愈傷組織的鮮重、不定芽的分化和生根均有一定影響。在一定范圍內，鮮重增長量隨pH值的上升而上升，pH值為6.2時，達到峰值，之后又隨之下降。當培養基偏酸性即pH值為5.4時，不定芽的分化率低，葉片為淺綠色、水分含量高;pH值為6.2時，不定芽分化數量相對較多，且葉片顏色深綠，水分含量少，抗逆性強;當培養基為中性即pH值為7.0時，不定芽分化極少，可能是由于中性環境的培養基過硬，不利于生長調節物質在胞內的運輸，以致愈傷組織難以吸收養分，難以分化形成不定芽。
2.4 溫度對紅花培養物的影響紅花分為春播和復播，春播紅花適宜期在4月上旬; 春播紅花在5月份處于出苗、分枝期,溫度較適宜。復播在6月左右，復播紅花7、8月處于苗期和花期生長階段, 出苗期間氣溫偏高，出苗速度加快，花期是紅花開花授精、籽粒開始形成的關鍵時期，故生長期間需要有較好的光熱及水肥條件,要求日平均氣溫保持在25～27℃。本實驗將培養物分別置于18℃，21℃，24℃，27℃，30℃下培養，比較不同溫度對培養物的培養效果，結果見表3，24℃是愈傷組織培養的最佳溫度，24～27℃形成的不定芽狀態都較好，但21℃生根效果較好。這證明了較高的氣溫利于出苗。表2 pH值對紅花生長的影響“-”表示無 ; “ ”表示生長緩慢 ; “ ”越多表示效果越好
2.5 濕度對紅花培養物的影響紅花有強大的直根(根深達213 c
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