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復發及難治急性髓細胞白血病病人多藥耐藥基因檢測及意義
【摘要】 目的 研究復發及難治急性髓細胞白血病(AML)病人多藥耐藥基因(mdr1)的表達及其與臨床療效的關系。方法 采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RTPCR)檢測65例AML病人(其中初診組38例，完全緩解組14例，復發難治組13例)、27例非白血病病人和健康人(包括健康人15例、缺鐵性貧血病人10例、特發性血小板減少性紫癜病人2例)mdr1基因的表達水平，并分析其臨床意義。結果 AML病人mdr1基因表達陽性率高于對照組，復發難治組mdr1基因表達陽性率高于初診組和完全緩解組，臨床耐藥組mdr1基因表達陽性率顯著高于非臨床耐藥組，CR率非臨床耐藥組顯著高于臨床耐藥組，差異均有顯著性(χ2=8.334～49.630，P<0.01)。結論 mdr1基因陽性表達與AML病人臨床耐藥密切相關，是影響預后的重要因素，可作為檢測臨床耐藥和判斷預后的指標之一。
【關鍵詞】 白血病 髓樣 多藥耐藥相關蛋白質類 抗藥性 腫瘤
[ABSTRACT]ObjectiveTo study the expression of multidrug resistance gene (MDRG) and the curative effect in relapse or refractory acute myelogenous leukemia (AML).MethodsA semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) was used to investigate the transcription levels of the human MDRG in 65 AML patients and 27 controls, and analyze the its clinical significance.ResultsMDRG expression was significantly higher in AML patients than in the controls, and higher in relapsed/refractory AML patients than in those newly diagnosed or in complete remission. The gene expression was significantly lower in nonresistant patients than in resistant ones. Complete remission (CR) rate of nonresistant patients was higher than resistant ones (χ2=8.324-49.630，P<0.01).ConclusionMDRG overexpression is significantly associated with clinical multidrug resistance and prognosis, and it is one of the indicators for predicting the prognosis of AML.
[KEY WORDS]leukemia, myeloid; multidrug resistanceassociated proteinsmdr1; drug resistance, neoplasm
國內外研究證明，多藥耐藥基因(mdr1)的存在及表達是產生多藥耐藥(MDR)的主要機制。本文應用逆轉錄聚合酶鏈反應(RTPCR)技術檢測了65例急性髓細胞白血病(AML)病人、27例非白血病病人和健康人的mdr1基因表達水平，分析mdr1基因表達水平與臨床耐藥的關系。
1 材料和方法
1.1 細胞系與細胞培養
K562/A02由中國醫學科學院血液學研究所惠贈，用阿霉素(ADM)誘導K562細胞建立的多藥耐藥細胞株[1]，具有典型的MDR表型。K562/A02細胞在培養過程中加1 ng/L的阿霉素，使用前3 d撤藥。
1.2 病人及分組
根據白血病診斷標準[2]，選擇急性髓細胞白血病(AML)病人65例，男39例(年齡18～63歲)，女26例(年齡22～59歲)，中位年齡34.2歲。其中初診組(AMLP)38例，完全緩解(CR)組(AMLC)14例，復發難治組(AMLR)13例;M0和M1各1 例，M219例，M315 例，M414 例，M59例，M62例，M71例，雜合型白血病(HAL)3例。對照組27例，其中男16例(年齡19～52歲)，女11例(年齡15～46歲)，中位年齡30.9歲，包括健康人15例、缺鐵性貧血病人10例、特發性血小板減少性紫癜病人2例。15例健康人取外周血，余均取骨髓。病人為青島大學醫學院附屬醫院及聊城市人民醫院住院病人。
臨床耐藥診斷標準：①對一線方案誘導治療2個療程無效;②第1次緩解后6個月內復發;③第1次緩解后6個月以上復發經誘導治療無效;④2次或2次以上復發。
1.3 半定量RTPCR
細胞總RNA的提取：用TRIzol提取細胞總RNA。經MMLV逆轉錄酶合成cDNA，以逆轉錄產物加dNTPs、PCR Buffer、mdr1引物進行PCR，取PCR產物定量10 μL 擴增產物，25 g/L瓊脂糖凝膠電泳，灌膠前加EB(1 mL 1×TAE 加1 μL EB)，75 V，30～60 min，紫外線燈下觀察并照相，用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software及GD1數字化凝膠成像分析儀掃描，計算mdr1基因與βactin的比值。
1.4 統計學處理
應用醫學統計學軟件SPSS 12.0處理，結果用±s表示，數據間比較用F檢驗及χ2檢驗。
2 結 果
2.1 AML病人mdr1基因的表達
AMLP組、AMLC組、AMLR組和對照組mdr1基因表達值分別為0.78±0.76、0.54±0.45、1.64±1.75、0.20±0.13，AML病人mdr1基因表達值高于對照組，且AMLR組高于AMLP組、AMLC組，差異有顯著性(P<0.001)。見圖1。
圖1 mdr1基因表達的RTPCR檢測
�、費arker;②AMLP;③AMLR;④AMLC;⑤AMLM5;⑥Normal;⑦K562/A02;⑧K562
根據對照組和AML各組mdr1基因在不同組別的表達，將mdr1/βactin的比值≥1.0定為mdr1基因陽性表達，對照組mdr1與βactin比值均<0.1，根據此標準，AMLR組mdr1基因陽性表達率顯著高于AMLP組和AMLC組，差異有顯著性(χ2=9.578、8.324，P<0.05)。見表1。表1 各組AML病人mdr1基因陽性表達組別n陽性例數陽性率AML病人臨床耐藥組mdr1基因陽性表達率顯著高于非臨床耐藥組，差異有顯著性(χ2=32.42，P<0.01)，CR率非臨床耐藥組顯著高于臨床耐藥組，差異有顯著性(χ2=49.63，P<0.01)。見表2。
表2 AML病人mdr1基因表達與臨床耐藥的關系組 別nmdr1陽性(例)表達率(χ%)CR(例)CR率(χ%)臨床耐藥251768.0416.0非臨床耐藥40410.03895.0
【論文摘要】《英語課程標準》關于教學中應注意的問題部分指出:“在教學過程中,要始終體現學生的主體地位,教師應充分發揮學生在學習過程中的主動性和積極性,激發學生的學習興趣,營造寬松、和諧的學習氣氛”。
【論文關鍵詞】英語教學;課堂;效率
教學實踐證明,同樣的課文,同樣的教學內容,同樣水平的學生,由于教學方法不同,教學效果往往大不一樣。因此,研究如何運用各種教學要素,按照最佳的方式組織教材,提高課堂教學效率,使學生英語教學真正做到“輕負擔,低消耗,高效率”具有十分重要意義。
在近幾年的教學實踐中,本人就優化課堂教學過程,做出了一些嘗試和探索,現談一些粗淺的認識和體會。
俗話說,良好的開端是成功的一半。頭開好了,基礎打好了,成功就有望了。對剛開始接觸英語的學生來說,當英語教師第一堂課用“English”來陳述一番時,他們覺得挺新鮮,很好奇,好象面對的就是外國人,覺得了不起,此時此刻,那種我也要那樣,我一定要學好英語的想法就會油然而生。教師就以次作為入口點,給學生講述成功人士學好外語的典型例子,激勵他們的學習動機,在課堂教學中采取各種各樣生動有趣的教學方法和相關手段進一步激發學生濃厚的學習興趣。
1. 通過講課時的眼神、表情并配合必要的動作來激發
在教“cold”一詞時,我聳聳肩,搓搓手說“oh,it is.I’m cold”然后我問全班學生“Are you cold?”得到回答是:“Yes,we are。”我又指著掛在窗口 大衣,問旁邊一位學生,“Is this your coat?Is it yours?”他說“Yes。”接著我用關切的目光告訴他,“put on your coat or you’ll have a cold ”就這樣,學生既輕松地學會了單詞“cold”,其中又體現了老師對學生的一片關愛之心。其次,采用簡筆畫。課上教師通過寥寥幾筆就能足夠勾劃出所學內容,學生也會饒有興趣地學著畫起來,對所學印象加深了,就不易忘記。再次,使用圖片、實物或自制教具。在教時間時,我自制了一只能撥動的時鐘,先是老師問,學生答,再讓學生學著邊撥鐘,邊用英語問“What’s the time?/What time is it?”于是,時間的問答及“It is time to…”的巨型也熟練地掌握了。最后,利用對話、游戲。豐富多樣的教法能使學生真正做到耳聽、眼看、心想、口說、手寫,能完善聽說讀寫各種能力,大大地調動了學生的積極性,促使他們樂學,使他們能在輕松愉快的氛圍中掌握所學內容。
2. 改進教法,進行學法指導
著名教育學家葉圣陶先生主張“教是為了不教”,陶行知先生指出,教師的責任是“教學生學”。簡而言之,教師在教學中的作用是“指導”兩字。教學改革家魏書生教改的核心經驗,也是指學生自學。在教學過程中,教師是教育者,是主導,教師的任務是把教學內容傳授給學生,在教學過程中做到精講多練、重點突出、中心明確、言簡意明、能解決學生的疑難問題。多講不僅要保證課堂練習的數量和時間,而且要講究練的方法,提高練的質量。只有將講授、閱讀、聽說和練習有機結合巧妙搭配起來,才有利于使學生對所學的知識做到懂、熟、會,并在課堂上基本解決問題。學生是受教育者,是主體,學生應該成為學習的主人,學生的主動性和學習的質量都有賴于教師的教導,教師要讓他們“學會學習”,就必須重視學法指導,指導學生學會預習、聽課、記筆記,指導學生獨立完成作業、復功課,鼓勵學生在課堂上積極思考、大膽發言,培養學生提出問題、發現問題、分析問題和解決問題的能力。
3. 分層教學,面向全體學生
人與人之間的智力是有差別的,面對不同層次學生組成的群體,要想大面積提高教學質量,關鍵在于:如何對待學生與學生之間的個體差異,解決好教學要求與學生接受能力不一致這一矛盾。在課堂教學中,首先要面向全體學生,對每類學生的要求要具體、要貼切,做到因材施教。平時備課和上課時,我做到分層次設計教案, 分步實現教學目標和要求,使每個學生在每一節課上都有收獲,對基礎知識扎實、接受能力強的學生教學時高起點、快節奏、大容量,要求這些學生對有關知識的掌握一步到位;對基礎差、分析理解及接受能力較差的學生教學時低起點、慢節奏,小容量、反復練,允許這些學生逐步掌握已學知識,使每個學生都懷有不同程度的喜悅,充分調動全體學生的學習積極性。
4. 信息反饋,及時查漏補缺
英語與其他學科一樣,知識內容由淺入循序漸進、環環相扣、密不可分。這就要求學生平時要有塌實的學風,認真做好預習復習,溫故而知新,就象滾雪球一樣,經常不斷地進行知識積累。教師要有嚴格的教風,在每一節課,每單元教完后都要進行信息反饋,隨時了解學生對以學知識的掌握、遺忘程度,學到一定階段讓學生自己小結,發現問題及時彌補。如在學完了人稱代詞和物主代詞后,讓學生總結歸納人稱代詞的主格、賓格;形容詞性的物主代詞、名詞性的物主代詞的形式及其用法,使學生能以正確形式靈活地應用句子中去。在講詞匯的同時,讓學生復習回顧同音詞、近意詞、反義詞、一詞多意。對前后知識時常進行語法歸納、幫助學生克服遺忘,及時反饋教學信息,使課堂教學更具針對性,有利于學生及時掌握準確的信息,揚棄錯誤概念,提高學生的綜合能力,正確系統地掌握所學知識。
多年的實踐使我深刻體會到,如果要在教學中樹立正確的教學觀念改變教學方法,注重學生創新思維能力培養,挖掘學生的創造潛能,教師必須經常更新知識,充實自己,保護學生的好奇心和求知欲,引導學生大膽思考,這樣才能使英語課堂的教學效率得到根本的提高。
3 討 論
白血病細胞對多種化療藥物產生耐藥性是造成白血病化療失敗的主要原因，是血液腫瘤治療亟待解決的問題。關于MDR的形成機制，近來已成為國內外研究的熱點之一。近30年的研究發現，多藥耐藥的機制非常復雜，其中多藥耐藥基因mdr1編碼的P糖蛋白(Pgp)的陽性表達被認為是血液腫瘤耐藥產生的主要機制[3]。推測Pgp可能通過3種方式引起MDR：①藥物被動擴散入細胞后，在漿膜面與Pgp結合并被泵至細胞外;②基于許多抗癌藥物均具有親脂疏水的特點，認為藥物與Pgp在脂質雙分子層內結合，未進入腫瘤細胞即被泵出;③進入胞內的藥物由Pgp泵入胞質內膜腔，再通過出胞作用排出細胞。 Pgp在人體大多數正常的組織中均低表達，而在MDR細胞中高表達，且Pgp表達的增加與MDR耐藥株的耐藥程度呈正相關。LOO等[4]的研究表明,Pgp與藥物的結合是一種底物誘導契合機制，這種機制決定了Pgp具有能作用于大范圍的不同結構化合物的特性。總之，Pgp可對多種化療藥物產生耐藥，從而造成化療失敗。因此，檢測AML病人mdr1基因的表達對于了解病人的耐藥情況，采取逆轉耐藥與化療同時進行治療具有一定的臨床意義。
本文應用RTPCR檢測了65例AML病人和對照組mdr1基因的表達情況，與大多數報道不同的是，我們分組研究了初發、CR和復發難治AML病人 mdr1基因的表達，研究結果顯示,AML病人mdr1基因的表達陽性率高于對照組;復發難治組mdr1陽性表達率顯著高于初診組和緩解組，mdr1基因在復發組中表達率高，提示經過長期化療的篩選，耐藥細胞株存活或者經藥物誘導產生耐藥，是復發組急性白血病誘導緩解率低、預后差的原因。吳少玲等[5]的研究顯示,急性白血病病人mdr1表達明顯高于對照組，孟繁軍等[6]研究也表明復發組和臨床耐藥組表達水平明顯高于初治組和完全緩解組。另有研究顯示，Pgp陽性白血病細胞內DNR/Rh123的濃度顯著低于Pgp陰性細胞，并且細胞內DNR/Rh123的濃度隨著樣本Pgp陽性率的增加而降低[7]。
本實驗還探討了mdr1基因與AML病人臨床耐藥及療效的關系，結果顯示，AML病人臨床耐藥與mdr1基因陽性表達密切相關，臨床耐藥組mdr1陽性表達率顯著高于非耐藥組;mdr1基因陰性表達組的CR率明顯高于mdr1基因陽性表達組，mdr1基因陽性表達嚴重影響CR率。因此我們推測，mdr1基因陽性表達是判斷病人對誘導治療是否耐藥的可靠預測指標，可作為檢測臨床耐藥和判斷預后的指標之一。有研究結果還表明，部分mdr1基因表達陰性的病人也出現了耐藥，提示耐藥現象的出現不是單一的一種基因或蛋白參與的結果[8]。譚耀紅等[9]在分析K562/A02細胞的耐藥機制時發現，mdr1 mRNA明顯升高，TOPⅡmRNA明顯下降，Bcl2表達增高，GST活性增強，端粒酶活性增強，Pgp和sorcin過表達，進一步說明了耐藥機制的復雜性。
【參考文獻】
[1]YANG C Z, LUAN F J, XIONG D S, et al. Multidrug resistance in leukemic cell Lane K562/A02 induced by doxorubicin[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 1995,16(4):333337.
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[3]LEE W P. Purification, cDNA cloning and expression of human sorcin in vincristine resistance HOB1 lymphoma cell lines[J]. Arch Biochem Biophysic, 1996,325(2):217226.
[4]LOO T W, BARTLETT M C, CLARK D M. Substrateinduced conformational changes in the transmembrane segments of human Pglycoprotein. Direct evidence for the substrateinduced fit mechanism for drug binding[J]. J Biol Chem, 2003,278:13603 13606.
[5]吳少玲,張殿紅,賈秀珍. nm232H1基因在急性白血病中表達及與多藥耐藥關系[J]. 齊魯醫學雜志, 2005,20(2):122125.
[6]孟繁軍,羅兵,曲彥. 急性白血病多藥耐藥基因MDR1表達及臨床意義[J]. 青島醫學院學報, 1999,35(3):181183.
[7]WANG Y H, MOTOJI T, MOTOMURA S, et al. Recovery of drug sensitivity by MS209, a new multidrug resistance reversing agent, on acute myelogenous leukemia blasts and K562 cells resistant to adriamycin cell line[J]. Eur J Haematol, 1997,58:186194.
[8]TAN Y H, LI G Y, ZHAO C H, et al. Expression of sorcin predicts poor outcome in acute myeloid leukemia[J]. Leukemia Research, 2003,27(2):125131.
[9]譚耀紅,趙春華,楊純正. 用cDNA Array分析K562/A02細胞多藥耐藥機制[J]. 中國醫學科學院學報, 2001,23(3):272274.
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