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無(wú)細(xì)胞合成生物技術(shù)的進(jìn)展探究
合成生物技術(shù)一經(jīng)興起，便得到全世界的廣泛關(guān)注，下面是小編搜集整理的一篇探究無(wú)細(xì)胞合成生物技術(shù)進(jìn)展的范文，供大家閱讀參考。
1合成生物技術(shù)
合成生物學(xué)是新出現(xiàn)的一門(mén)綜合了分子生物學(xué)、工程學(xué)、數(shù)學(xué)等許多研究?jī)?nèi)容的交叉學(xué)科，它借鑒工程化的思想研究生命，目的是通過(guò)人工設(shè)計(jì)和構(gòu)建高效、可控的生物系統(tǒng)來(lái)解決能源、材料、健康和環(huán)保等問(wèn)題[1].ScientificAmerican的編輯DavidBiello曾經(jīng)用一個(gè)簡(jiǎn)單的比喻來(lái)說(shuō)明什么是合成生物技術(shù)：如果將生命比作電腦，那么，由許多核酸組成的程式碼-基因體，就是生命的作業(yè)系統(tǒng)。合成生物技術(shù)想做的就是，透過(guò)創(chuàng)造或改寫(xiě)基因組，讓生命表現(xiàn)出預(yù)期的行為，執(zhí)行預(yù)定的工作。
合成生物技術(shù)一經(jīng)興起，便得到全世界的廣泛關(guān)注。早期合成生物技術(shù)的研究?jī)?nèi)容主要為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)控元件的設(shè)計(jì)與合成;現(xiàn)階段的研究?jī)?nèi)容擴(kuò)展為通過(guò)系統(tǒng)生物學(xué)指導(dǎo)，理性組裝各種合成生物元件，使其成為定向執(zhí)行某種生物功能的代謝通路、系統(tǒng)或者一種全新的細(xì)胞[2].經(jīng)過(guò)10余年的探索，細(xì)胞體內(nèi)代謝途徑的構(gòu)建已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，其中的典型代表即為Keasling課題組[3,4]利用合成生物技術(shù)的方法在大腸桿菌和釀酒酵母中均成功構(gòu)建的紫穗槐二烯(青蒿素前體物)的合成路徑，建立了有效而價(jià)廉的青蒿素合成方法。伴隨基因組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的不斷進(jìn)步，合成生物技術(shù)將會(huì)給產(chǎn)品開(kāi)發(fā)帶來(lái)革命性的影響，為世界帶來(lái)新一輪產(chǎn)業(yè)發(fā)展浪潮。中國(guó)已經(jīng)制訂了合成生物技術(shù)戰(zhàn)略路線(xiàn)圖，規(guī)劃了技術(shù)、工業(yè)應(yīng)用、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等方面的中長(zhǎng)期目標(biāo)：未來(lái)5年，爭(zhēng)取建立標(biāo)準(zhǔn)元件數(shù)據(jù)庫(kù)，形成化學(xué)品和生物材料的模塊化設(shè)計(jì)和生產(chǎn)能力;未來(lái)10年，力爭(zhēng)形成生物系統(tǒng)設(shè)計(jì)、建模和驗(yàn)證一體化平臺(tái)，商業(yè)化生產(chǎn)眾多自然化合物、藥品、化學(xué)品和生物燃料。
但是，在實(shí)際操作過(guò)程中，并不是所有人工設(shè)計(jì)的代謝途徑都能在宿主細(xì)胞體內(nèi)表現(xiàn)出預(yù)期的效果，原因主要有以下幾方面：生物系統(tǒng)構(gòu)建復(fù)雜難以預(yù)測(cè);許多人工合成的生物元件與宿主細(xì)胞的兼容性問(wèn)題;目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的抑制;生物系統(tǒng)的穩(wěn)定性問(wèn)題等[5].相比于調(diào)控活細(xì)胞的代謝，體外多酶催化體系顯得更具靈活性及可操作性。
2無(wú)細(xì)胞的合成生物技術(shù)-多酶催化體系
無(wú)細(xì)胞的合成生物技術(shù)的核心思想為體外多酶催化體系的構(gòu)建，即模仿體內(nèi)代謝途徑，在體外組合一系列酶及輔酶，構(gòu)建復(fù)雜的生化代謝網(wǎng)絡(luò)以獲得目標(biāo)產(chǎn)物的過(guò)程[6].無(wú)細(xì)胞的合成生物技術(shù)近年得到很大提升，并不斷迅速發(fā)展。這種快速的發(fā)展基于無(wú)細(xì)胞的合成生物技術(shù)平臺(tái)的幾個(gè)重要特點(diǎn)[7~9],包括：
(1)沒(méi)有宿主細(xì)胞的生理調(diào)控系統(tǒng)，反應(yīng)條件更容易控制，可以方便地進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化;(2)不存在副反應(yīng)和宿主細(xì)胞本身的代謝需求，能夠達(dá)到更高的產(chǎn)品得率和產(chǎn)品純度;(3)可以使用高負(fù)載量的酶，用于提高反應(yīng)速率;(4)寬泛的反應(yīng)條件(如高溫、有機(jī)相催化體系)、底物的自由選擇，解決了底物或中間產(chǎn)物的毒性問(wèn)題;(5)具有相當(dāng)大的工業(yè)化潛力。
無(wú)細(xì)胞的合成生物技術(shù)可以看作一個(gè)基于三要素的集成式平臺(tái)，包括：代謝途徑重新構(gòu)建、酶工程和反應(yīng)工程[10].代謝途徑重新構(gòu)建需要以體內(nèi)代謝途徑為基礎(chǔ)，組裝相應(yīng)的酶和輔酶。與體內(nèi)代謝途徑可以自動(dòng)平衡輔酶和產(chǎn)生腺苷三磷酸(ATP)不同，構(gòu)建體外代謝途徑必須設(shè)計(jì)輔酶再生系統(tǒng)和ATP合成體系。此外，需要進(jìn)行詳細(xì)的熱力學(xué)分析，以確保設(shè)計(jì)的代謝途徑和預(yù)期相符。酶工程經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，是一個(gè)相對(duì)成熟的研究領(lǐng)域，涉及酶的發(fā)現(xiàn)、酶的大量制備、理性設(shè)計(jì)、定向進(jìn)化和酶的固定化等。反應(yīng)工程包括生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)(如膜反應(yīng)器、流加反應(yīng)器、連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器)、多個(gè)反應(yīng)的級(jí)聯(lián)、反應(yīng)條件的優(yōu)化等。
3多酶催化體系的構(gòu)建策略
3.1底物通道效應(yīng)
多酶催化體系反應(yīng)過(guò)程中，中間產(chǎn)物要經(jīng)分離純化才能進(jìn)行下一步產(chǎn)應(yīng)。中間產(chǎn)物在分離過(guò)程中損失較大，產(chǎn)率相對(duì)較低。對(duì)催化反應(yīng)的多種酶進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，在一定空間內(nèi)實(shí)現(xiàn)級(jí)聯(lián)催化，可有效減少反應(yīng)步驟及反應(yīng)設(shè)備的初始投入，減少中間產(chǎn)物的擴(kuò)散阻力、增加其局部濃度，降低中間產(chǎn)物在分離過(guò)程中的損失，提高最終產(chǎn)物的收率。
底物通道效應(yīng)(substratechanneling)指在多酶催化的代謝途徑中前一個(gè)酶所催化產(chǎn)生的產(chǎn)物直接進(jìn)入下一個(gè)酶的活性中心，而不是擴(kuò)散進(jìn)入所在的反應(yīng)體系環(huán)境中[11].在傳統(tǒng)的生物催化級(jí)聯(lián)過(guò)程中，所有的酶均勻分布在反應(yīng)器中，存在酶穩(wěn)定性差、產(chǎn)物分離復(fù)雜、酶難以回收、環(huán)境耐受性差以及中間傳遞效率等諸多問(wèn)題，因此，需要發(fā)展有效的固定化酶策略來(lái)實(shí)現(xiàn)多酶催化的底物通道效應(yīng)，同時(shí)可以保持酶的活力穩(wěn)定性及重復(fù)使用性。
多酶催化體系的固定化是酶工程領(lǐng)域的前沿課題之一，探索和研究新的固定化技術(shù)，開(kāi)發(fā)適用范圍廣、可應(yīng)用于多酶催化的固定化酶載體材料，為多酶體系創(chuàng)造適宜的微環(huán)境是這一領(lǐng)域的基礎(chǔ)性研究。
當(dāng)前多酶催化體系的固定化主要有以下方式：簡(jiǎn)單的多酶融合、使用支架系統(tǒng)進(jìn)行共固定化、簡(jiǎn)單的共固定化及位置組裝的共固定化等(圖1)[12~16].多酶催化體系的固定化效果與載體的選擇有很大關(guān)系，載體材料的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)對(duì)固定化酶的活性有很大影響[17].隨著固定化技術(shù)的發(fā)展，載體材料由最初的天然高分子材料，擴(kuò)展到合成高分子材料、無(wú)機(jī)材料及現(xiàn)在備受關(guān)注的復(fù)合材料。復(fù)合載體材料綜合利用高分子材料和無(wú)機(jī)材料優(yōu)點(diǎn)，與其他載體材料相比，具有特殊功能的復(fù)合材料有巨大優(yōu)勢(shì)，因此復(fù)合材料是固定化載體材料發(fā)展的必然趨勢(shì)[18,19].
基因工程領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展表明，生物偶合可以提供相應(yīng)的工具以更加可控的方式構(gòu)建多酶催化體系，通過(guò)人工合成的結(jié)合域，可以將參與反應(yīng)的多個(gè)酶共同固定于支架體系，如RNA支架系統(tǒng)、DNA支架系統(tǒng)、合成蛋白支架系統(tǒng)、自組裝蛋白支架體系等。在利用RNA分子作為支架系統(tǒng)方面，Delebecque等[20]利用RNA分子適配體將產(chǎn)氫需要的2種酶進(jìn)行了空間組裝，利用RNA分子的折疊形成一維或者二維的腳手架結(jié)構(gòu)從而實(shí)現(xiàn)酶分子的空間構(gòu)建，其中二維結(jié)構(gòu)的RNA腳手架結(jié)構(gòu)使氫的產(chǎn)量提高了48倍。在利用DNA分子作為支架系統(tǒng)方面，Wilner等[21]以DNA分子作為腳手架形成六角形結(jié)構(gòu)，將葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)2個(gè)酶進(jìn)行固定化，將酶分子聚集后反應(yīng)速率大幅度提高。在利用蛋白質(zhì)作為支架體系方面，不僅可以利用自然界存在的蛋白作為支架，也可以人工構(gòu)建新的蛋白支架體系。細(xì)菌纖維小體是多種纖維素酶、半纖維素酶依靠錨定-黏附機(jī)制所形成的一種多酶體系，通過(guò)細(xì)胞黏附蛋白附著在細(xì)菌的細(xì)胞壁上。近年來(lái)，通過(guò)模仿自然界中纖維小體的構(gòu)造人工合成纖維小體得到了廣泛研究，Tan課題組[22]利用來(lái)自Clostri-diumcellulovorans,C.cellulolyticum,C.thermocellum的錨定結(jié)構(gòu)域和黏附結(jié)構(gòu)域構(gòu)建了人工纖維小體，通過(guò)黏附-錨定機(jī)制將降解纖維素的酶固定到釀酒酵母細(xì)胞壁的表面，將纖維素降解后在酵母體內(nèi)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生成生物乙醇。利用這種方法，乙醇的產(chǎn)量最高達(dá)到1.4g/L.另外，利用蛋白質(zhì)的自組裝進(jìn)行多酶體系的構(gòu)建也具有廣闊的應(yīng)用前景，借助蛋白質(zhì)的自組裝完成多酶體系的構(gòu)建只需要將蛋白質(zhì)或者酶分子進(jìn)行簡(jiǎn)單的混合而不需要進(jìn)行特殊處理。Dueber等[23]利用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程相關(guān)蛋白的一部分作為蛋白支架體系構(gòu)建腳手架，3個(gè)支架蛋白包括GTP酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GBD)、SH3結(jié)構(gòu)域(SH3)和PDZ結(jié)構(gòu)域(PDZ)。
通過(guò)將催化乙酰CoA到甲羥戊酸的3個(gè)酶-乙酰CoA硫解酶(AtoB)、HMG-CoA合成酶(HMGS)和HMG-CoA還原酶(HMGR)分別與GBD,SH3,PDZ的配基相連，利用配基與蛋白支架之間的特異性相互作用從而將3種酶分子組成多酶復(fù)合體，通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化支架體系，調(diào)節(jié)不同支架蛋白的比例，甲羥戊酸的產(chǎn)量最高提高了77倍。
3.2生物積塊(buildingblocks)與模塊(modules)的構(gòu)建
無(wú)細(xì)胞的合成生物技術(shù)采用自下而上的設(shè)計(jì)策略，包括生物積塊的構(gòu)建(單獨(dú)的酶)、幾種酶組合成的功能模塊的構(gòu)建(產(chǎn)物生成模塊、輔酶再生模塊、ATP合成模塊)和復(fù)雜代謝途徑的組裝及應(yīng)用(以糖為底物生產(chǎn)氫氣等)。體內(nèi)代謝途徑的標(biāo)準(zhǔn)生物組件是對(duì)應(yīng)的DNA序列，體外代謝途徑的標(biāo)準(zhǔn)生物組件則是各種酶。通過(guò)將多個(gè)酶組合成功能模塊，再將不同的功能模塊進(jìn)行組裝，可以實(shí)現(xiàn)體外代謝途徑的構(gòu)建。
酶催化的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，約30%是氧化還原反應(yīng)，這些反應(yīng)需要輔酶/輔因子的參與，如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD(P)H)或黃素腺嘌呤二核甘酸(FAD)。宿主細(xì)胞可以通過(guò)合成代謝和分解代謝的平衡來(lái)調(diào)節(jié)輔酶/輔因子的量，體外多酶催化體系則需要不斷補(bǔ)充輔酶/輔因子。在體外構(gòu)建多酶催化體系，底物的成本需要遠(yuǎn)低于產(chǎn)物的價(jià)值，因此，通過(guò)組合積塊構(gòu)建廉價(jià)的輔酶再生模塊顯得尤為重要[24].
NADPH是最常見(jiàn)的輔酶，其在體外的再生可以通過(guò)以單個(gè)酶催化底物供氫體或級(jí)聯(lián)多個(gè)酶來(lái)進(jìn)行反應(yīng)[25].單酶構(gòu)建的NADPH再生模塊已被廣泛用于合成各種化合物。3種代表性的單酶構(gòu)建的NADPH再生模塊是醇/醇脫氫酶、甲酸/甲酸脫氫酶和葡萄糖/葡萄糖脫氫酶[26,27].以1個(gè)多酶催化體系中輔酶再生模塊的構(gòu)建為例，1個(gè)由12個(gè)酶組成的體外多酶催化體系，以纖維二糖為底物生成1個(gè)單位的葡萄糖可以產(chǎn)生12單位的NADPH[28].在所有的供氫體化合物中，成本最低的是糖類(lèi)，但以它們?yōu)榈孜飿?gòu)建輔酶再生模塊需要添加較多的酶，增加了系統(tǒng)的復(fù)雜性。利用電化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行輔酶再生成本較低且相對(duì)清潔無(wú)污染，但NADPH在高電位時(shí)穩(wěn)定性很差，如果想在工業(yè)上應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)，必須解決現(xiàn)存的問(wèn)題。
ATP是所有生物體的通用能量。與宿主細(xì)胞內(nèi)可以不斷合成ATP不同，在體外多酶催化體系中，如果某些反應(yīng)需要ATP參與，需要設(shè)計(jì)ATP再生模塊，低成本ATP再生是其面臨的一個(gè)最關(guān)鍵的障礙。
體外ATP再生的方法包括底物水平磷酸化、NADPH的氧化磷酸化和光誘導(dǎo)ATP合成[29,30].
目前應(yīng)用最廣泛的體外ATP再生技術(shù)是底物水平磷酸化，常見(jiàn)的磷酰基供體包括乙酰磷酸、磷酸二羥丙酮和磷酸肌酸等。這些磷酸鹽的利用會(huì)導(dǎo)致磷酸根的積累，從而改變pH,抑制體系中的酶活。此外，過(guò)高的底物成本也導(dǎo)致其不能應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。
使用非磷酸鹽的化合物可避免磷酸根積累的問(wèn)題。
通過(guò)利用糖酵解途徑中的反應(yīng)，葡萄糖和丙酮酸鹽已作為底物用于無(wú)細(xì)胞體系中ATP的合成。最近，由麥芽糖糊精磷酸化酶介導(dǎo)的反應(yīng)以麥芽糖糊精作為底物生成ATP,與葡萄糖相比，每單位麥芽糖糊精可以多生成1個(gè)ATP,同時(shí)生成可以緩慢釋放能量的化合物葡萄糖-6-磷酸，更可能應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)[31].
4多酶催化體系的應(yīng)用
無(wú)細(xì)胞多酶催化體系的應(yīng)用最初可以追溯到100多年前。1897年，EduardBuchner使用酵母提取物將糖轉(zhuǎn)化成乙醇和二氧化碳，憑借這一成就，他獲得了1907年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。從那時(shí)起，無(wú)細(xì)胞多酶催化體系逐漸為人們所熟知并加以應(yīng)用。無(wú)細(xì)胞多酶催化體系的構(gòu)建不僅能在一定程度上克服體內(nèi)代謝途徑的缺點(diǎn)，還擁有產(chǎn)量高、純度高以及反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)成為合成高價(jià)值化合物和生物能源的一種新選擇[32].
4.1生物制氫
無(wú)細(xì)胞合成體系最初在生物產(chǎn)氫研究領(lǐng)域取得了較大的突破。美國(guó)橡樹(shù)嶺國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的Woodward等[33]利用葡萄糖-6-磷酸作為反應(yīng)底物，在體外成功構(gòu)建了1條生物產(chǎn)氫的催化途徑，最終每摩爾葡萄糖-6-磷酸經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)得到了11.6摩爾氫氣。然而，葡萄糖-6-磷酸作為反應(yīng)底物存在幾個(gè)缺點(diǎn)：成本偏高;游離的磷酸作為最終產(chǎn)物會(huì)結(jié)合Mg2+,從而影響參與反應(yīng)的部分酶的活力;磷酸積累造成pH波動(dòng)過(guò)大，不利于體系的平衡[34].弗吉尼亞理工大學(xué)的Zhang課題組[31]為了解決這些問(wèn)題，將葡聚糖作為反應(yīng)起始底物，利用低聚的糖苷鍵和多糖的化學(xué)鍵能量，通過(guò)添加少量可回收利用的磷酸根離子和適當(dāng)?shù)牧姿峄�，在原有途徑基礎(chǔ)上引入了從葡聚糖到葡萄糖-6-磷酸的兩步反應(yīng)，取得顯著效果，氫氣產(chǎn)量提高到12mol/mol(底物)，且不需添加ATP.由于葡聚糖價(jià)格更低(約0.15$/kg)、更易獲得，因此新途徑能有效降低生產(chǎn)成本(圖2)。2013年，Zhang課題組[35]在體外構(gòu)建了利用木糖產(chǎn)氫氣的無(wú)細(xì)胞合成體系(圖3)。可以預(yù)見(jiàn)，通過(guò)使用更為廉價(jià)的底物可以進(jìn)一步降低成本，為生物產(chǎn)氫工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。
4.2生物食品和生物燃料
纖維素是地球上含量最豐富的有機(jī)化合物之一，并且是可再生能源的一種理想原材料來(lái)源。如今，它還能夠解決人類(lèi)的溫飽問(wèn)題。在一項(xiàng)新的研究中，Zhang課題組[36]找到了一種將纖維素轉(zhuǎn)化為淀粉的新途徑。為了實(shí)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)化，他們選擇了植物、真菌和細(xì)菌來(lái)源的內(nèi)切葡聚糖酶-纖維二糖水解酶、纖維二糖磷酸化酶和a-葡聚糖磷酸化酶，通過(guò)基因設(shè)計(jì)與優(yōu)化，人工合成具有大腸桿菌密碼子偏好性的基因序列，在大腸桿菌中表達(dá)，最終得到了需要的酶，并在體外構(gòu)建了多酶催化體系(圖4)。與將纖維素完全分解為葡萄糖，再重新將其組裝為淀粉不同，他們首先將纖維素分解為纖維二糖，隨后將纖維二糖分解為葡萄糖及G-1-P,G-1-P起到構(gòu)建直鏈淀粉模塊的作用。通過(guò)這種體外多酶催化體系，他們可將高達(dá)30%的纖維素轉(zhuǎn)化為淀粉，剩下的纖維素水解為葡萄糖，通過(guò)酵母的轉(zhuǎn)化在同一生物反應(yīng)器中生產(chǎn)乙醇。
可以預(yù)見(jiàn)，下一代的生物精煉廠(chǎng)將會(huì)使用這種體外多酶催化體系同時(shí)生產(chǎn)食品和生物燃料。
丁醇是一種高品質(zhì)的汽油替代燃料，與傳統(tǒng)的乙醇燃料相比有很大優(yōu)勢(shì)：能量密度高，接近于汽油;親水性低，能與汽油高比例混合;可以使用現(xiàn)有石油管道進(jìn)行運(yùn)輸?shù)�。此外，丁醇還是一種重要的大宗化工產(chǎn)品，每年全球市場(chǎng)需求達(dá)50萬(wàn)噸左右。近幾年來(lái)，美國(guó)UCLA的Liao課題組[37]對(duì)異丁醇的生物制造進(jìn)行了深入研究。通過(guò)利用支鏈氨基酸的生物合成途徑和Ehrlich途徑，在大腸桿菌等模式生物中構(gòu)建了異丁醇的生物合成途徑，可以把糖轉(zhuǎn)換為異丁醇。但異丁醇的體內(nèi)合成面臨諸多限制因素，其中之一即為使用重組大腸桿菌生產(chǎn)異丁醇，當(dāng)產(chǎn)量達(dá)到1%~2%(v/v)時(shí)，異丁醇即對(duì)宿主產(chǎn)生毒性作用，從而降低了宿主的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)物收率。TUM的Sieber課題組[38]設(shè)計(jì)了一種體外的多酶催化體系可以將葡萄糖轉(zhuǎn)化為異丁醇或乙醇。他們?nèi)斯?gòu)建了最小化的糖酵解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)只需要添加一種輔酶(圖5略)。在耐受性試驗(yàn)中，無(wú)細(xì)胞的多酶催化體系在異丁醇產(chǎn)率高達(dá)4%(v/v)時(shí)反應(yīng)速率仍不受到影響。
4.3生物制藥
抗生素是由微生物或高等動(dòng)植物所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物。目前臨床常用的抗生素很多是由基因工程菌發(fā)酵得到，在體外構(gòu)建多酶催化體系生產(chǎn)抗生素，可以避免基因工程菌在合成抗生素時(shí)產(chǎn)生的自我抑制情況，具有很好的發(fā)展前景。加州大學(xué)圣地亞哥分校的Moore課題組[39]2007年首次在體外構(gòu)建了II型聚酮類(lèi)化合物的合成途徑，該體系利用苯甲酸及丙二酰CoA作為反應(yīng)底物，在外源補(bǔ)加ATP及NADPH的條件下得到了天然抗生素-腸球菌素(圖6)。
除此之外，無(wú)細(xì)胞多酶催化體系也已經(jīng)應(yīng)用于其他領(lǐng)域，如精細(xì)化工合成[40]、生物閉合電路構(gòu)建[41]、無(wú)細(xì)胞蛋白合成[42]和各種單糖或多聚糖合成[43].
5總結(jié)
無(wú)細(xì)胞合成生物技術(shù)由于其高度可控及構(gòu)建體外代謝途徑的方法多樣，正逐漸成為一個(gè)強(qiáng)大的技術(shù)平臺(tái)，能夠完成許多體內(nèi)代謝途徑無(wú)法完成的工作。相對(duì)于傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵生產(chǎn)，無(wú)細(xì)胞多酶催化體系擁有諸多優(yōu)勢(shì)，但其未來(lái)的應(yīng)用仍存在相當(dāng)大的挑戰(zhàn)，即其應(yīng)用存在一定的局限性。這種局限性表現(xiàn)在兩個(gè)方面：(1)缺乏通用的積塊(酶或輔酶)，使其成本偏高�，F(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)最重要的就是標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模化，只有通過(guò)基因工程手段構(gòu)建大量熱穩(wěn)定的、價(jià)格低廉的酶，并發(fā)展仿生輔酶類(lèi)似物，才能大幅降低無(wú)細(xì)胞合成生物技術(shù)的成本，使其可以與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng);(2)反應(yīng)速率仍有待大幅提高�？梢酝ㄟ^(guò)優(yōu)化多酶體系的催化模型、代謝流分析、增加底物濃度、增加酶裝載量、提高反應(yīng)溫度等手段加快反應(yīng)速率、提高催化效率。對(duì)于無(wú)細(xì)胞的合成生物技術(shù)，現(xiàn)階段的發(fā)展目標(biāo)是在低成本和工業(yè)化大規(guī)模的基礎(chǔ)上構(gòu)建可控的、高效的多酶催化體系。
可以充分挖掘無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的潛能，實(shí)現(xiàn)更好的學(xué)習(xí)、控制和調(diào)節(jié)。隨著酶制備成本的降低及酶工程技術(shù)的不斷提高，相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)，無(wú)細(xì)胞的合成生物技術(shù)將越來(lái)越多地應(yīng)用于生物制造業(yè)。
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