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簡述梨黑星病菌的分離培養和基質研究
[論文關鍵詞] 梨黑星病菌 培養基質 苦皮藤
[論文摘要] 用18種培養基對梨黑星病菌進行分離培養結果表明,用PDA、改進PDA及PSA培養較易分離成功,在改進PDA+L′中營養生長速率最大,20℃下培養20 d菌落直徑可達12 mm,并產生分生孢子。效測定試驗表明,10.0μg/mL的70%代森錳鋅或5%殺菌清水劑及5.0μg/mL的植物制劑20%苦皮藤水浸液,對梨黑星病菌分生孢子萌發有很高的抑制作用,抑制率分別達100%,100%和78.71%。
梨黑星病(Venturia prinaAderh)是我國南北梨產區普遍發生的重要病害之一。近年來,由于種植結構和品種布局的變化,常導致梨黑星病大流行。梨黑星病不僅危害葉片、葉柄、嫩枝和果實,而且常引起葉片早期脫落、果實畸形,造成品質和產量下降,嚴重影響樹勢和梨業生產。而該菌目前分離培養較困難,人工培養下生長緩慢,對研究該菌的生理生化特點、侵染發病規律、室內外藥效試驗等帶來不便。為此,作者等嘗試篩選適宜于該菌分離和生長的培養基及有效的殺菌劑。
1 與方法
1.1 材料
1.1.1 供試病原菌 分別采自陜西楊陵、彬縣、乾縣果園。
1.1.2 供試培養基 先后共試用了18種固定配方與改良配方培養基,其配方如下:(1)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA);(2)馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基(PSA);(3)梨葉浸汁麥芽浸膏培養基(LY);(4)梨果浸汁麥芽浸膏培養基(LG);(5)PDA+梨果汁培養基(PDA+G);(6)甘氨酸等微量元素瓊脂培養基(A);(7)PSA+梨果汁培養基(PSA+G);(8)PSA+梨塊培養基(PSA+L);(9)PDA+熟梨塊培養基(PDA +L′);(10)PSA+胡蘿卜塊培養基(PSA+H);(11)PDA+熟胡蘿卜塊培養基(PDA+H′);(12)木糖培養基(MD);(13)多種培養液(PB、PDB);(14)燕麥片瓊脂培養基(Y);(15)V8瓊脂培養基(V8);(16)麥芽膏瓊脂培養基(M);(17)牛肉浸膏瓊脂培養基(N);(18)瓊脂培養基(Q)。其中,PB、PDB為液體培養基,其余均為固體培養基。
1.1.3 供試 70%代森錳鋅、5%殺菌清水劑和12.5%烯唑醇均為市售,植物制劑20%苦皮藤水浸液由西北科技大學農藥研究所提供。
1.2 試驗方法
1.2.1 病菌分離 在上述17種固體培養基上,分別用常規組織分離法和單孢分離法[1,2]對所采病葉進行分離,每種培養基分3皿,每皿內放材料9塊(單孢挑9個),于10,15,20,25,30℃5種溫度下培養,選擇最適溫度,并將分離物進行活體定點接種。
1.2.2 病菌在不同基質上生長速率測定 將分離物制成φ=4 mm的菌餅,接入上述18種培養基,每處理重復3次,20℃下黑暗培養,觀察菌絲生長情況。
1.2.3 藥效測定 用孢子萌發法[1,2]測定70%代森錳鋅、5%殺菌清水劑、12.5%烯唑醇、植物制劑20%苦皮藤水浸液對梨黑星病菌的抑制作用。4種藥劑均設置0.625,1.25,2.5,5.0和10.0μg/mL 5個濃度,以清水為對照,置20~23℃下培養12 h。萌發百分率及抑制率計算公式如下:
2 結果與分析
2.1 分離基質篩選
各種培養基上的分離結果表明,在PDA+G、PSA、PDA、PSA+G、PSA+L、PSA+H、PDA+L′培養基上,以組織分離法可獲得梨黑星病菌。單孢分離僅在PDA+G、PSA、PDA培養基上見到極少菌落,在LY、LG培養基上采用組織分離法所獲病菌生長極弱,在V8、Y、M、A、LG、LY、N等其余供試培養基上病菌生長緩慢,且易被雜菌污染。將所得分離物接種于楊陵果園的梨樹葉片上,15 d觀察到產生的分生孢子,證明分離成功。比較5種不同的溫度處理在PDA培養基上對梨黑星病菌生長的影響(表1),結果表明,梨黑星病菌分離培養的最適溫度為20~25℃,15℃以下及超過25℃時,生長緩慢。
2.2 病菌在不同培養基質上的生長情況比較
培養基質比較試驗結果(表2)表明,梨黑星病菌在PDA+L′上生長最快,一般20 d菌落直徑可達12 mm,在PDA+H′、PSA及A上次之,G上生長最慢。由于在其余培養基上生長極為緩慢,故未再列表贅述。
2.3 效測定
表3表明,70%代森錳鋅10.0μg/mL和5%殺菌清水劑10.0μg/mL,對梨黑星孢子萌發的抑制率均高達100%,效果明顯優于其他農藥。植物制劑20%苦皮藤水浸液5. 0μg/mL抑制率也可達78.71%,這說明該植物制劑在防治梨黑星病中有很大潛力。
3 討論
用17種培養基對梨黑星病菌進行分離的結果表明,PDA、改進PDA及PSA較易分離成功,組織分離法的成功率高于單孢分離法。其成功率的高低還與所采的新鮮程度關系密切,試驗表明,如果在發病初期采褪綠斑或是剛產生微薄霉層的標本,隨采隨分成功率可達90%以上,反之,成功率很低。據有關資料報道,分離時采用麥芽瓊脂培養基成功率最高[3],進入夏季不宜用單孢分離法。本研究結果表明,只要分離過程中消毒時間掌握好,將pH值調節到適宜于該菌生長的偏酸中,一般在該菌發生時間(4~10月)[4]采集的標本用上述PDA+G、PSA、PDA、PSA+G、PSA+L、PAS+H、PHA+L′等培養基進行組織分離均可獲得成功,而且很少有污染,20℃下7~10 d菌落直徑可達3~4 mm,并產生少量分生孢子。本試驗中也采用黑光燈照射,意在誘導產孢[5],但發現其對該菌的生長有促進作用,對產孢效果卻不理想。另外,利用無糖PB或降低糖含量的PDB進行培養,菌絲生長也較快,10 d菌落直徑可達9~10 mm(用十字交叉法,從瓶底測量其菌落直徑[1,2])。說明該菌在無糖或少糖條件下,有利于營養生長。雖然已有資料研究出了產孢方法[6],但產孢量仍很少,室內藥效試驗還有賴于田間發病后采集的標本。其分離物的產孢機理、培養時需黑光還是黑暗、或是散光、以及基質營養等條件,均有待于進一步研究。
在藥效測定試驗中,10.0μg/mL 70%代森錳鋅和10.0μg/mL 5%殺菌清水劑對梨黑星孢子的萌發抑制率均高達100%。植物制劑20%苦皮藤水浸液5.0μg/mL抑制率也達78.71%,雖低于試驗中的化學農藥,但其低毒、低殘留、對環境無污染,且低,在殺菌劑領域具有很大的發展潛力。如果將該試劑的濃度加大是否也能達到與化學制劑相同或近似的效果,有待于進一步試驗證實。
[參考文獻]
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[6] 李保華,趙美琦,張美蓉,等.梨黑星病菌分生孢子侵染及產孢研究[J].植物病理學報,1998,28(4):297-298.
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