造血干細(xì)胞自我更新相關(guān)基因的研究進(jìn)展
【關(guān)鍵詞】 造血干細(xì)胞 自我更新 基因研究
在機(jī)體的一生中，由小部分全能造血干細(xì)胞來產(chǎn)生祖細(xì)胞與成熟血細(xì)胞。為了在如此長的時(shí)期內(nèi)維持造血，造血干細(xì)胞（HSCs）具備平衡定向分化與自我更新的能力是至關(guān)重要的。自我更新指由親代細(xì)胞分裂而成的兩個(gè)子代細(xì)胞，其中一個(gè)保留造血干細(xì)胞全部生物學(xué)特征，從而維持干細(xì)胞池的大小，即干細(xì)胞數(shù)量與質(zhì)量的恒定。具備自我更新能力是HSCs的標(biāo)志性特征，但該過程發(fā)生與調(diào)控的分子機(jī)制尚不明確。在本文中，筆者將綜述最近發(fā)表的文獻(xiàn)，即對(duì)影響HSCs自我更新的基因的過表達(dá)或敲除的研究，總結(jié)目前已知的HSCs自我更新的分子調(diào)控子及這些途徑相互作用的可能方式。
1 HOX
同源盒（HOX）基因是編碼調(diào)節(jié)擬胚體形成與器官發(fā)生的進(jìn)化上比較保守的一類轉(zhuǎn)錄因子，是許多組織，包括造血系統(tǒng)中干細(xì)胞發(fā)育的一關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。HOXa5與HOXa10是長期造血干細(xì)胞（LT?HSCs）的特異性標(biāo)志，HOXa2在長/短期造血干細(xì)胞（LT?HSCs，ST?HSCs）表面均有表達(dá)，HOXa9表達(dá)于造血干細(xì)胞與種系決定祖細(xì)胞［1］。Ferrell等［2］還發(fā)現(xiàn)HOXa9與HOXa10可上調(diào)Wnt信號(hào)通路中Wnt10b與其受體卷曲蛋白1，5（Frizzled1，5）基因的表達(dá)。
轉(zhuǎn)錄因子HOXb4最早被發(fā)現(xiàn)高水平表達(dá)于人富含長期培養(yǎng)起始細(xì)胞（LTC?ICs）的CD34+CD38-/loCD45RA-CD71-骨髓細(xì)胞，而在稍成熟的祖細(xì)胞中消失。用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)HOXb4入小鼠骨髓細(xì)胞，經(jīng)5?FU處理后，在15%FBS，IL?3、IL?6與SCF中培養(yǎng)10～14 d，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中重建細(xì)胞數(shù)目增長了40倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未轉(zhuǎn)導(dǎo)HOXb4的對(duì)照組。由此認(rèn)為，HOXb4的持續(xù)表達(dá)在某種程度上可阻止細(xì)胞因子誘導(dǎo)的HSCs的分化。Buske等［3］發(fā)現(xiàn)HOXb4表達(dá)水平升高，導(dǎo)致具有干/祖細(xì)胞特性的人臍血細(xì)胞數(shù)量大大增加，并增強(qiáng)了造血干/祖細(xì)胞的增殖活性。擴(kuò)增后的HSCs具正常造血重建功能、種系分化特異性和LTC?ICs活性。
在小鼠模型中利用Cre/loxP技術(shù)將HOXb4基因完全敲除，造血干細(xì)胞池的重建會(huì)受到影響。Brun等［44］也發(fā)現(xiàn)HOXb4缺失小鼠可發(fā)生相對(duì)正常的造血發(fā)育，但存在中度的增殖缺陷。移植HOXb4?/?HSCs的SCID小鼠對(duì)5?FU的耐受增強(qiáng)。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中，小鼠骨髓來源的原始造血祖細(xì)胞或集落形成能力并無顯著差異，但后者對(duì)外源性生長因子的增殖應(yīng)答降低。且競(jìng)爭(zhēng)性重建造血分析表明，HOXb4-/-細(xì)胞的重建造血能力降低2倍［4］。
2 Bmi?1
Bmi?1是polycomb group（PcG）家族的一員，高表達(dá)于小鼠與人原始骨髓細(xì)胞。已有研究表明Bmi?1參與調(diào)節(jié)HSCs的增殖［5］。Bmi?1基因敲除小鼠的研究證實(shí)，盡管Bmi?1缺失胚胎胎肝中的HSCs數(shù)目維持正常，這種小鼠在出生后2月內(nèi)死于廣泛漸進(jìn)性的全血細(xì)胞缺失，包括原始祖細(xì)胞的缺失［6］。Park等［7］用RT?PCR與基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)在造血發(fā)育中表達(dá)下降的Bmi?1，在純化的小鼠與人HSCs上高度表達(dá)。競(jìng)爭(zhēng)性再生試驗(yàn)表明，移植自Bmi?1-/-小鼠獲得的胎肝細(xì)胞與新生骨髓細(xì)胞10周后，受體內(nèi)幾乎沒有供體來源的成熟造血細(xì)胞［7］。這是因?yàn)楣w來源的HSCs不能進(jìn)行自我更新。Bmi?１過表達(dá)可增強(qiáng)HSCs的對(duì)稱分裂，介導(dǎo)細(xì)胞分裂時(shí)保持stemness遺傳。而且，Bmi?1表達(dá)增強(qiáng)致多潛能祖細(xì)胞的體外大量擴(kuò)增，HSCs體內(nèi)重建造血能力顯著提高。功能丟失分析表明，Bmi?1缺失與HSCs的自我更新缺陷緊密相關(guān)［5,8］。
Bmi?1通過調(diào)節(jié)干細(xì)胞命運(yùn)決定基因、存活基因、抗增殖基因預(yù)感細(xì)胞相關(guān)基因來調(diào)控HSCs的自我更新［7］。Park等［7］發(fā)現(xiàn)Bmi?1-/-HSCs呈現(xiàn)幾種表達(dá)在胚胎，神經(jīng)與造血干細(xì)胞的基因的異常表達(dá)，以及幾種調(diào)節(jié)細(xì)胞循環(huán)與凋亡的基因表達(dá)的改變，包括細(xì)胞周期抑制因子p16INK4a與 p19ARF 的上調(diào)及凋亡抑制因子AI?6的下調(diào)。這些可能用以解釋Bmi?1-/-小鼠體內(nèi)HSCs的缺失：上調(diào)p16INK4a基因與衰老相關(guān)；下調(diào)AI?6與上調(diào)p19ARF可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
3 Shh
Sonic hedgehog（Shh）是一種共價(jià)結(jié)合膽固醇的分泌形蛋白，在動(dòng)物發(fā)育中發(fā)揮重要作用［9］。許多Hh家族成員信號(hào)分子參與體外培養(yǎng)時(shí)血細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的產(chǎn)生，Hh蛋白可刺激定向造血干/祖細(xì)胞的增殖。Hh通路變異或用Hh信號(hào)抑制劑環(huán)杷明處理的金龍魚胚胎呈現(xiàn)成體造血干細(xì)胞形成缺陷［8］。加Hh及Shh中和抗體入含1個(gè)SCID重建細(xì)胞（SRC）的103CD34+CD38-Lin-細(xì)胞培養(yǎng)體系，然后將這些細(xì)胞以有限稀釋法注入NOD/SCID小鼠體內(nèi)，7 d后，仍只含1個(gè)SRC。用可溶性Shh處理的細(xì)胞可在體內(nèi)產(chǎn)生大量的人造血細(xì)胞，表明HSCs應(yīng)答Hh信號(hào)進(jìn)行自我更新分裂［10］。
已有研究表明，Shh活性與BMP信號(hào)相關(guān)。Noggin，BMP?4的天然抑制物，可抑制Shh誘導(dǎo)的表型原始的造血細(xì)胞的增殖，其模式類似于Hh中和抗體。因此，Shh作為HSCs的一個(gè)調(diào)節(jié)因子，可能與其它轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合作用，依賴于下游的BMP信號(hào)［10］。
4 Wnt
Wnt蛋白是另一類重要的干細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用。已有研究表明，在胚胎及成體造血干/祖細(xì)胞發(fā)育中，Wnt信號(hào)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［9，11］。Feng等也發(fā)現(xiàn)在小鼠ES細(xì)胞向造血分化時(shí)，Wnt?β?連環(huán)蛋白（Wnt信號(hào)通路的一下游激活子）被下調(diào)，表明Wnt信號(hào)在小鼠ES細(xì)胞向造血分化中發(fā)揮作用。將純化的小鼠Wnt3a加入c?kit+ ThyloSca?1+Lin-小鼠骨髓細(xì)胞，隨后將之注入致死量照射的小鼠體內(nèi)，6周后進(jìn)行多譜系移植分析。發(fā)現(xiàn)，HSCs應(yīng)答純化Wnt3a經(jīng)歷自我更新［12］。用逆轉(zhuǎn)錄病毒將Wnt3轉(zhuǎn)導(dǎo)入hTERT基質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其過表達(dá)增強(qiáng)Wnt?β?連環(huán)蛋白信號(hào)，致顯著的形態(tài)學(xué)改變與生長遲緩。共培養(yǎng)2周后，試驗(yàn)組與對(duì)照組中CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增無明顯差別，但實(shí)驗(yàn)組的鵝卵石區(qū)形成顯著減少。
Wnt 可以與Frizzled家族成員或低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP）結(jié)合發(fā)揮作用，激活該受體復(fù)合物可致β?連環(huán)蛋白（β?catenin）的累積�；钚驭�?catenin的過表達(dá)可產(chǎn)生20～49倍擴(kuò)增的c?kit+ ThyloSca?1+Lin-表型的細(xì)胞［13］。相反，axin（促進(jìn)β?catenin的降解，進(jìn)而抑制Wnt信號(hào)）或Frizzled配體結(jié)合域（阻斷可溶性Wnt的結(jié)合）的異常表達(dá)導(dǎo)致體外培養(yǎng)HSCs的增殖抑制與重建造血能力的減弱［１４］。為了研究Wnt信號(hào)在體內(nèi)內(nèi)環(huán)境是否有活性，Reya等［14］用帶GFP 的LEF?1/TCF（lymphoid enhancer factor?1/T cell factor，與β?catenin相互作用，促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄）感染HSCs。將其移植入小鼠體內(nèi)，他們分析表達(dá)GFP的HSCs，表明內(nèi)源性干細(xì)胞可應(yīng)答Wnt信號(hào)。他們還觀察到β?catenin轉(zhuǎn)導(dǎo)的HSCs表達(dá)3～4倍或更高水平的HOXb4與Notch1，表明HSCs自我更新的調(diào)節(jié)因子間可能存在相互作用。
5 Notch
在進(jìn)化上高度保守的 Notch信號(hào)可導(dǎo)致譜系特異性基因的轉(zhuǎn)錄抑制，保持祖細(xì)胞的未分化狀態(tài)。已有研究表明，Notch通路在造血細(xì)胞發(fā)育的不同階段影響其生存、增殖及分化，包括造血干細(xì)胞的自我更新及分化［9］。
Notch信號(hào)在抑制分化中發(fā)揮重要作用。隨著HSCs分化，其表達(dá)水平被下調(diào)。抑制Notch信號(hào)導(dǎo)致HSCs體外加速分化，體內(nèi)缺失。Notch信號(hào)參與Wnt介導(dǎo)的維持HSCs未分化狀態(tài)［15］。用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠Notch4的活性形式（Int?3）入富含干細(xì)胞的小鼠骨髓細(xì)胞，培養(yǎng)2周后，發(fā)現(xiàn)Int?3轉(zhuǎn)導(dǎo)組分化標(biāo)志物的表達(dá)更低，且較對(duì)照組其集落形成細(xì)胞CFU?GM/BFU?E數(shù)目高出3～5倍［16］。轉(zhuǎn)導(dǎo)Notch4的活性部分（Notch?IC）入人臍血CD34+CD38-細(xì)胞。較之對(duì)照組，其總的髓系集落形成細(xì)胞顯著減少（3～10倍），但其長期擴(kuò)增能力增強(qiáng)。將轉(zhuǎn)導(dǎo)的臍血細(xì)胞移植入NOD/SCID?β2-/-小鼠，在其骨髓與脾內(nèi)均可檢測(cè)到CD34+CD38-細(xì)胞［17］。
已有研究表明骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的Jagged1（Notch配體之一）可促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增［18］；盡管之前Walker與Karanu等已經(jīng)分別證實(shí)Jagged1?Notch通路可維持CD34+細(xì)胞處于不成熟狀態(tài),且人Jagged1可誘導(dǎo)具多譜系重建能力的人干細(xì)胞的存活與增殖。
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