布氏鏡檢查丁酸鈉影響HT

布氏鏡檢查丁酸鈉影響HT

                                    作者：劉成霞 張尚忠 劉宗印 黃麗華 張孝衛(wèi)

【關(guān)鍵詞】  多功能透射顯微鏡(布氏鏡)；丁酸鈉；HT
　　【摘要】  目的  觀察丁酸鈉對結(jié)腸癌HT２９細胞形態(tài)和生物學特性的影響。方法  多功能透射顯微鏡(布氏鏡)動態(tài)觀察丁酸鈉作用前后HT２９細胞的生長狀態(tài)、細胞運動及貼壁過程的變化。結(jié)果  丁酸鈉5 mmol/L作用24 h后，HT２９細胞數(shù)量明顯減少，細胞巢變小，巢內(nèi)細胞數(shù)減少；細胞變成圓形 ，細胞大小趨于一致；細胞核內(nèi)染色質(zhì)呈塊狀聚集，折光性降低，呈現(xiàn)出凋亡細胞形態(tài)；貼壁過程明顯變緩。結(jié)論  丁酸鈉可以改變HT２９的生長狀態(tài)，抑制其生長；布氏鏡可以動態(tài)地觀察藥物作用前后培養(yǎng)細胞的形態(tài)、微細結(jié)構(gòu)及運動的變化，是一項先進的、具有實用價值的檢查技術(shù)。
　　【關(guān)鍵詞】  多功能透射顯微鏡(布氏鏡)；丁酸鈉；HT２９細胞株
　　【Ａbstract】  Ｏbjective  To investigate the effect of sodium butyrate on the appearance and  bionomics of colon cancer line HT２９．Ｍethods  Viewing the effect of sodium butyrate on differences of the growth,as well as the cell movement,and the adherence procedure of HT２９ with bradford variable projective microscopy (BVPM).Ｒesults  Ａfter 24 hours of coincubation of HT２９　and sodium butyrate (5mmol/L),it was showed that the amount of HT２９ decreased,the cell nests shrank,and the cell population of each cell nest diminished;most of the HT29 changed into  globular,and the bulk of HT２９ looked welldistibuted;chromatin gathered uneven,and the refraction weaken,many of them looked as apoptosis cells;adherence procedure of HT２９ stepped down obviously.Ｃonclusion  Sodium butyrate may inhibit HT２９ growth  and monitoring the changes of cultured cells in cytomorph，fine structure and its movement consecutively with BVPM is an advanced and practical examination technique.
　　【Ｋey　words】  braford  variable projective microscopy (BVPM), sodium butyrate,ＨＴ２９ cell line
　　對腫瘤細胞進行體外培養(yǎng)，同時給予藥物干預是目前研究和篩選抗腫瘤藥物的主要方法之一。但關(guān)于藥物對培養(yǎng)的活體腫瘤細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化研究尚未見報道。本研究應(yīng)用布氏鏡對丁酸鈉作用前后HT２９細胞形態(tài)和微細結(jié)構(gòu)的變化進行動態(tài)圖像掃描與分析，清晰地觀察到HT２９細胞形態(tài)學和生物學行為的動態(tài)變化和丁酸鈉對腫瘤細胞的影響。
　　1  材料和方法
　　1．１  布氏鏡(bradford variable projective microscopy,BVPM,可變投射顯微鏡的簡稱)BVPM１５型，美國生物公司生產(chǎn)。
　　１．２  細胞株  結(jié)腸癌HT２９細胞株，購自山東省醫(yī)學科學院。
　�。保�３  藥物和標本制備
　　1．３．１  丁酸鈉(Sodium Butyrate):購于Sigma公司，用PBS配制成01 mol/L的儲存液，4 ℃保存?zhèn)溆�。臨用前用培養(yǎng)液稀釋成實驗所需濃度。
　　132  細胞培養(yǎng)方法和標本制備：將15 mm×15 mm大小的蓋玻片經(jīng)常規(guī)泡酸、清洗、高壓消毒處理后備用。結(jié)腸癌HT２９細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清(杭州四季青生物制品公司)的RPMI1640(Hyclone),在37℃、5%的CO２、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞，用025%的胰蛋白酶消化，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×１０４／ml。將細胞接種到預先放置蓋玻片的培養(yǎng)皿中，每孔接種6 ml。置37 ℃、5%CO２恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，待細胞接近長成單層，更換培養(yǎng)液，加入丁酸鈉，使終濃度為5 mmol/L，對照組加入等量的PBS。經(jīng)丁酸鈉作用24 h后，終止培養(yǎng)。取出蓋玻片，布氏鏡觀察。
　　2  結(jié)果
　　2．１  丁酸鈉對HT２９細胞生長狀態(tài)的影響  常規(guī)培養(yǎng)24 h觀察，處于對數(shù)生長期的HT２９細胞呈巢狀生長，巢內(nèi)細胞密集，細胞間連接緊密，細胞界限不清。細胞巢較大，多見80～１００個細胞組成的大細胞巢。巢內(nèi)細胞呈梭形或長圓形，細胞大小懸殊，可見處于不同分裂期的細胞及雙核、多核細胞，細胞表現(xiàn)出活躍的生物學狀態(tài)。丁酸鈉5 mmol/L作用24 h后觀察，細胞明顯減少，細胞巢變小，巢內(nèi)細胞數(shù)多在20～４０，巢內(nèi)細胞松散，單個細胞界限清楚。視野內(nèi)幾乎見不到梭形細胞，細胞變成圓形，細胞大小趨于一致。
　�。玻�２  丁酸鈉對HT２９細胞形態(tài)的影響  正常培養(yǎng)24 h觀察，處于對數(shù)生長期的HT２９細胞核大，核漿比例可達1∶１，部分細胞表現(xiàn)為核漿比例倒置。細胞核形狀、大小不一，核仁清晰，核內(nèi)染色質(zhì)豐富，積聚于核膜周圍。丁酸鈉5 mmol/L作用24 h后觀察，細胞核內(nèi)染色質(zhì)呈塊狀聚集，折光性降低，呈現(xiàn)出凋亡細胞形態(tài)。正常培養(yǎng)的HT２９細胞膜表現(xiàn)為明顯的不規(guī)則性，細胞呈不定形。每個細胞可見20～３０個胞質(zhì)突起，呈指狀、球狀或不規(guī)則形，可見偽足的形成及迅速變形，形態(tài)多樣、多變。丁酸鈉5 mmol/L作用24 h后動態(tài)觀察，每個細胞可見3~５個球狀突起，變化緩慢。
　�。玻�３  丁酸鈉對HT２９細胞貼壁運動的影響  取經(jīng)胰酶消化的正常HT２９單細胞懸液，滴于載玻片上，再加蓋玻片后立即觀察。腫瘤細胞在貼壁生長的過程中胞漿豐富，呈流動性，細胞原生質(zhì)伸展和收縮，使細胞伸出偽足，細胞變形，以阿米巴樣運動完成貼壁過后繼續(xù)生長。布氏鏡6000倍間隔1 min連續(xù)記錄下的HT２９細胞的貼壁過程，可見細胞貼壁迅速。丁酸鈉5 mmol/L作用24 h后，觀察HT２９細胞的胞漿流動性減慢，偽足、突起較少，貼壁過程明顯變緩。

3  討論
　　腫瘤細胞的生物學特性與腫瘤細胞的運動密切相關(guān)。細胞的運動，首先是伸出胞質(zhì)突，胞漿隨之進入胞質(zhì)突，形成阿米巴樣運動。在體內(nèi)，當腫瘤細胞脫離原發(fā)灶后，必須借助本身的阿米巴樣運動侵入細胞外基質(zhì)，進而侵入繼發(fā)部位形成轉(zhuǎn)移瘤，完成體內(nèi)侵襲和轉(zhuǎn)移的過程。體內(nèi)腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移與腫瘤細胞的運動性增強有關(guān)［１］。而體外培養(yǎng)細胞的運動則表現(xiàn)在細胞貼壁和生長過程中，細胞膜的迅速變化，細胞漿的快速流動預示著細胞的生長代謝活躍。
　　丁酸鈉是一種組蛋白去乙�；�酶抑制劑，它通過抑制組蛋白去乙�；�酶的活性，誘導腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄，促進細胞分化，抑制腫瘤細胞的生長。由于其具有毒性小、抗腫瘤作用好的特點，近年來被廣泛用于白血病、胃癌、大腸癌、前列腺癌、乳腺癌和頭頸部腫瘤的研究［２~５］。本研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉可以抑制HT29細胞的運輸能力，減弱其胞漿流動，從而抑制HT29的貼壁過程，丁酸鈉作用后，HT２９細胞形態(tài)變圓，細胞膜突起變少，細胞異型性減輕，細胞分裂減慢，明顯影響細胞的生長狀態(tài)。另外，由于用藥前細胞分裂活躍，處于分裂期的大細胞較多，細胞大小懸殊，導致細胞平均體積較大。丁酸鈉作用后，細胞大小趨于一致，細胞平均體積較用藥前減少約1／３，與李春蕊等［6］研究結(jié)果一致�？紤]可能與丁酸鈉誘導p21WAF1等細胞周期調(diào)控基因的表達有關(guān)。但李豐等［7］在普通光鏡下觀察了丁酸鈉對低分化人結(jié)腸癌Clone2A細胞形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)2 mmol/L丁酸鈉處理4 d后，細胞變長，并伸出較長的突起，趨向于成纖維細胞形態(tài)變化。為何不同細胞對丁酸鈉表現(xiàn)不同的反應(yīng)，機制不清，推測不同細胞株對藥物的敏感性不同，也可能與丁酸鈉的濃度和作用時間有關(guān)。
　　觀察藥物作用前后腫瘤細胞的變化是體外評價藥物抗癌效果的重要指標。普通光學顯微鏡只能觀察固定在載玻片上的細胞，不能進行動態(tài)觀察；倒置顯微鏡盡管可以觀察到培養(yǎng)細胞的生長狀態(tài)，但因其放大倍數(shù)有限(一般放大倍數(shù)為40～４００倍)，不能清楚的觀察活細胞的微細結(jié)構(gòu)和細胞的運動狀態(tài)。電子顯微鏡在觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)方面具有其他顯微鏡無可比擬的優(yōu)勢，但不能對活細胞進行觀察，且標本制作費時、復雜。布氏鏡具有40～１６ ００0倍的連續(xù)調(diào)節(jié)功能，同時具備相差、暗視野、微分干涉分析、中密度及偏振光等多種功能，應(yīng)用布氏鏡對體外培養(yǎng)的細胞進行動態(tài)圖像掃描，能清晰、直觀地觀察到活細胞的微細結(jié)構(gòu)和動態(tài)變化。通過丁酸鈉作用前后HT29細胞的變化，可以更直觀地觀察丁酸鈉對HT２９細胞生物學行為的影響。檢查只需將細胞培養(yǎng)在蓋玻片上，或?qū)⒓毎麘乙褐苯拥斡谳d玻片上直接觀察，無需固定、染色等處理，方法簡便，圖像直觀。
　　本研究發(fā)現(xiàn)，HT２９呈巢狀生長，細胞分裂旺盛、運動增強、貼壁過程迅速，呈現(xiàn)十分活躍的生物學特性；丁酸鈉可以改變HT２９的生長狀態(tài)，抑制其生長；布氏鏡可以動態(tài)地觀察藥物作用前后細胞形態(tài)、微細結(jié)構(gòu)及運動的變化，是一項先進的、具有實用價值的檢查技術(shù)。
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