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V基因定量分析技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值、存在問題及展望--HBV基因定量分析
V基因定量分析技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值、存在問題及展望--HBV基因定量分析技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值發(fā)布時(shí)間： 2003-8-12 作者：繆曉輝 孔憲濤
近年來HBV基因定量分析的價(jià)值受到越來越多研究者的重視[1]。過去由于過分強(qiáng)調(diào)了HBV感染后過強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，忽視了對(duì)病毒復(fù)制水平與致病性之間因果關(guān)系的研究。目前普遍認(rèn)為，盡管HBV不直接破壞寄生細(xì)胞，但病毒的活躍復(fù)制是啟動(dòng)或激發(fā)肝臟組織炎癥反應(yīng)的因素。這表明確定感染者體內(nèi)HBV復(fù)制狀態(tài)，即從HBV基因定量的角度作病情分析是十分有意義的。事實(shí)上，真正引起人們關(guān)注HBV基因定量分析價(jià)值的重要原因是最近發(fā)現(xiàn)了干擾素治療與HBV基因水平兩者之間有非常密切的關(guān)系。HBV基因定量分析還在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因治療、蛋白疫苗和核酸疫苗、抗HBV藥物體外試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)及耐藥研究、流行病學(xué)研究、HBV血液制品污染監(jiān)測(cè)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
一、HBV基因定量分析在干擾素治療中的應(yīng)用
尚無藥物可以清除所有HBV感染者體內(nèi)HBV顆粒。干擾素是目前唯一有一定療效的一類生物制劑[2],它在病毒等誘導(dǎo)下由幾種相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生，并發(fā)揮抗病毒作用。但是無論使用何種干擾素，也無論治療劑量或療程如何，干擾素治療后HBV轉(zhuǎn)陰率迄今仍保持在40%左右，無法進(jìn)一步提高，究竟有哪些制約因素起作用尚無定論。
近年來發(fā)現(xiàn)干擾素的治療效果，即干擾素治療后的反應(yīng)性(response)很大程度上取決于HBV在體內(nèi)的復(fù)制水平[2,3]。以下幾點(diǎn)事實(shí)值得注意:⑴治療前HBV低水平復(fù)制者的反應(yīng)性明顯優(yōu)于高水平復(fù)制者。HBV轉(zhuǎn)陰的幾乎都是那些治療前血清HBV DNA含量較低者，而治療前HBV DNA含量特別高者大多沒有療效；⑵治療中病毒復(fù)制水平迅速降低者，有望治愈。相反，治療期間HBV基因水平下降較慢，或下降幅度較小，或變化不明顯者，大多是無效者；⑶治療結(jié)束后，采用PCR定量法檢測(cè)，HBV DNA完全轉(zhuǎn)陰者可能不再?gòu)?fù)發(fā)，而終止治療后HBV DNA仍保持較低水平者，反跳的可能性較大�？梢�，使用干擾素治療HBV感染時(shí)，在各種近期和遠(yuǎn)期療效指標(biāo)中，除了病人的臨床表現(xiàn)是否好轉(zhuǎn)，生化指標(biāo)(ALT)是否改善，肝組織炎癥反應(yīng)是否減輕等以外，血清HBV DNA定量分析是一個(gè)十分重要的觀察項(xiàng)目。從現(xiàn)有研究資料看，除病理檢查外，HBV DNA定量檢測(cè)，也許是干擾素治療效果判斷依據(jù)中最直接、最可靠和最有價(jià)值的指標(biāo)。多數(shù)研究者認(rèn)為，通過HBV DNA定量分析來指導(dǎo)干擾素治療，有重大意義。首先，在治療對(duì)象的選擇方面，即確定干擾素治療適應(yīng)癥時(shí)，應(yīng)對(duì)各侯選病例在某個(gè)時(shí)間段內(nèi)定期反復(fù)檢? 釮BV DNA水平，那些長(zhǎng)期保持HBV高復(fù)制水平者不宜接受干擾并素治療，或應(yīng)當(dāng)聯(lián)合治療；其次，干擾素治療期間，可根據(jù)HBV基因水平的動(dòng)態(tài)變化適時(shí)調(diào)整治療劑量，決定是否縮短或延長(zhǎng)療程，及是否終止治療。這不僅對(duì)制訂合理的治療方案，也對(duì)減輕病人負(fù)擔(dān)，避免不恰當(dāng)用藥有指導(dǎo)意義[4]。筆者認(rèn)為，目前國(guó)際上普遍采用的所謂“六個(gè)月療程”及某些中高劑量治療方案均缺乏充分和足夠的立論依據(jù)，有必要結(jié)合基因定量分析結(jié)果，重新評(píng)價(jià)和制訂干擾素治療計(jì)劃；最后，干擾素治療結(jié)束后，對(duì)有反應(yīng)者定期作定量分析，有助于發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)者，并根據(jù)血清HBV DNA含量波動(dòng)情況決定是否實(shí)施再治療。有人報(bào)告，首次干擾素治療有效者，再治療的效果亦佳。如果第一次治療無反應(yīng)或反應(yīng)較差者，第二次干擾素治療仍不能取得理想療效[5]。
二、HBV基因定量分析的其他臨床價(jià)值
HBV感染后，在臨床表現(xiàn)方面的差異非常明顯,可以表現(xiàn)為無癥狀攜帶者、急性肝炎、慢性肝炎、暴發(fā)型肝炎、肝硬化及肝癌等多種疾病狀態(tài)。病毒在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制水平與各種臨床疾病狀態(tài)之間可能存在著某些必然聯(lián)系。由于HBV基因定量技術(shù)的發(fā)展和成熟，目前已有可能從某些現(xiàn)象上闡明HBV復(fù)制與致病性之間的“量效”關(guān)系。
㈠“無癥狀攜帶者”可能為活動(dòng)性乙肝患者[6]。有部分HBV感染者，由于免疫耐受或其它原因，體內(nèi)HBV呈復(fù)制不活躍的“潛伏”狀態(tài)，但并不意味著不存在進(jìn)行性肝損害。Mels等研究發(fā)現(xiàn)無癥狀攜帶者在其自然發(fā)展史上，HBV復(fù)制處于波動(dòng)狀態(tài)，時(shí)有加劇，病毒復(fù)制積累到一定程度后ALT水平增加。一般規(guī)律是:血清HBV DNA水平上升® ALT活性增加® IgM抗HBc滴度提高。因此無癥狀攜帶者應(yīng)采取積極治療措施，否則這類人群不僅作為重要的病毒庫(kù)傳播HBV，而且由于隱匿性肝細(xì)胞損傷的不斷積累，不經(jīng)過慢性肝炎階段，直接向肝硬化和肝癌發(fā)展。
㈡HBV DNA水平與HBV感染者病情和預(yù)后的關(guān)系密切。上述無癥狀攜帶者是一個(gè)特殊群體。而對(duì)那些急性和慢性乙型肝炎患者而言，HBV DNA水平對(duì)預(yù)后判斷有幫助。研究發(fā)現(xiàn)HBV DNA一直保持較高水平的急性肝炎患者易慢性化，而HBV復(fù)制水平較高的慢性肝炎患者不僅對(duì)干擾素治療的反應(yīng)性差，而且肝組織炎癥反應(yīng)更明顯，病情更重，更易發(fā)生肝硬化和肝癌。目前在能否用血清HBV DNA水平來判斷肝組織炎癥損傷程度這類問題上尚有爭(zhēng)議。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，鴨肝被DHBV廣泛感染的同時(shí)，并不伴隨明顯病毒血癥,肝細(xì)胞清除病毒的同時(shí)也無病毒血癥加重的證據(jù)[7]。然而最近有人對(duì)HCV感染者進(jìn)行基因定量分析研究，發(fā)現(xiàn)HCV RNA水平與ALT水平以及肝臟knodell分級(jí)之間有密切關(guān)系[8]。
㈢肝移植者HBV DNA定量的意義
Mazzaferro等報(bào)告肝移植前患者血清HBV DNA水平的高低決定移植后肝臟是否再感染HBV[9]。作者觀察到，14例移植前血清HBV DNA含量低于103拷貝/ml，移植后不間斷地采用HBsAb免疫預(yù)防，隨訪36個(gè)月，無一例再發(fā)肝炎，但另外兩例移植前病毒拷貝數(shù)大于105/ml則發(fā)生了嚴(yán)重HBV再感染。建議移植前使用抗HBV藥物，最大限度降低血清HBV DNA濃度，有助于防止HBV侵犯移植后肝臟，提高肝臟移植的效果。
㈣前核基因突變HBV定量意義
HBV前核基因突變可導(dǎo)致HBeAg表達(dá)缺失。感染不表達(dá)HBeAg的HBV突變株，或野生型HBV在體內(nèi)突變并成為優(yōu)勢(shì)株均產(chǎn)生較嚴(yán)重的后果，如易發(fā)生暴發(fā)性肝炎，預(yù)后差，干擾素治療無效等[9,10]。目前已能采用核酸序列測(cè)定技術(shù)、PCR技術(shù)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析技術(shù)等來定性檢測(cè)HBV前核基因突變。最近Baxall建立了一種PCR及產(chǎn)物的顯色反應(yīng)點(diǎn)突變分析技術(shù)(Colourimetric point mutation assay)，用來定量分析突變前核基因，有助于進(jìn)一步探討HBV突變與致病性之間的關(guān)系[11]。
基因定量分析是一項(xiàng)臨床應(yīng)用型技術(shù)，但對(duì)基礎(chǔ)研究也有一定的應(yīng)用價(jià)值[12]，尤其是在當(dāng)前基因治療、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、核酸疫苗等熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，基因定量分析可能是一種很好的輔助手段，對(duì)發(fā)現(xiàn)一些有意義的現(xiàn)象也許有一定幫助。比如HBV在轉(zhuǎn)基因小鼠組織臟器分布規(guī)律可用定量標(biāo)準(zhǔn)來衡量，以及用定量手段觀察各種藥物、細(xì)胞因子和其它物質(zhì)對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠HBV基因復(fù)制的調(diào)節(jié)作用。又如對(duì)核酸疫苗注入肌組織后的各種動(dòng)力學(xué)變化的研究遠(yuǎn)未深入，如能采用定量手段，分析抗原表達(dá)基因在體內(nèi)的存在狀態(tài)無疑是有益的。至于各種抗HBV藥物，無論是在體外細(xì)胞模型(包括轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型)還是在動(dòng)物模型的研究，或在人體研究，采用基因定量分析，應(yīng)當(dāng)是考核藥物療效的最佳手段[13]。
HBV因定量分析存在的問題及未來展望
HBV基因定量技術(shù)的發(fā)展歷史不長(zhǎng)，但由于有定性技術(shù)為基礎(chǔ)，以及與其它學(xué)科方法的融匯，發(fā)展速度很快，目前趨于成熟。但應(yīng)用定量技術(shù)去研究HBV感染的臨床問題還不充分，同時(shí)定量技術(shù)本身也有許多問題值得探討。
一、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化。這是一個(gè)最為突出而又必須盡快解決的問題。歐洲有一個(gè)“病毒性肝炎研究組”（European Study Group in Viral Hepatitis)，經(jīng)常向歐洲的某些研究機(jī)構(gòu)提供HBV血漿標(biāo)準(zhǔn)品作定量分析參考[14]。有必要在國(guó)際上設(shè)立統(tǒng)一的HBV基因標(biāo)準(zhǔn)品，包括各種HBV亞型的標(biāo)準(zhǔn)參照。筆者認(rèn)為，克隆的HBV DNA質(zhì)粒不適宜作標(biāo)準(zhǔn)品�？寺BV DNA與載體構(gòu)成了閉環(huán)超螺旋結(jié)構(gòu)，而且，一級(jí)結(jié)構(gòu)單一，這與體內(nèi)存在的HBV基因結(jié)構(gòu)差異很大。后者呈部分雙鏈，在血清中尚有裂解片段及復(fù)制中間體等形式。因此，無論是在分子雜交，還是在PCR過程中，質(zhì)粒HBV DNA結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)感染的HBV DNA結(jié)構(gòu)在雜交效率或擴(kuò)增效率上必然有細(xì)微差別，結(jié)果將影響定量分析的準(zhǔn)確性。如從高水平HBV陽(yáng)性病人血清大量抽提，或從轉(zhuǎn)基動(dòng)物血液中純化得到HBV DNA，可能是一個(gè)制備標(biāo)準(zhǔn)品的途徑�？傊�，國(guó)際化的標(biāo)準(zhǔn)參照，是保證HBV DNA定量技術(shù)精確性和可靠性的前提。
二、分子雜交定量技術(shù)和PCR定量技術(shù)應(yīng)當(dāng)共存下去嗎? 以下兩點(diǎn)值得考慮:首先，有必要弄清體內(nèi)HBV復(fù)制水平極低者(如低于1fg/ml)占HBV感染人數(shù)的比例有多大？這類低水平復(fù)制者預(yù)后如何?如果這類人群屬于急性感染恢復(fù)期，或有自然清除病毒傾向者，那么似無必要作常規(guī)PCR定量分析，定期進(jìn)行PCR定性檢測(cè)即可。其次，有必要建立一種敏感度介于分子雜交和PCR定量技術(shù)之間的檢測(cè)系統(tǒng)。最近有人利用電化學(xué)技術(shù)觀察到DNA雙鏈互補(bǔ)雜交，甚至單個(gè)堿基對(duì)結(jié)合時(shí)發(fā)生了微電反應(yīng)，這給我們以很大啟示，今后如有可能在這方面打開突破口，那么基因定量分析兩大技術(shù)共存的局面會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)變。但是，在目前這兩大技術(shù)仍有很強(qiáng)的互補(bǔ)性。
三、HBV突變株定量分析意義的研究。HBV基因突變[15]，尤其是前核基因突變，直接影響HBV感染病情轉(zhuǎn)歸及抗毒治療效果，同時(shí)也反映了來自體內(nèi)或外界選擇壓力的作用。因此，突變株在體內(nèi)產(chǎn)生的確切原因，突變株與野生株混合存在的發(fā)展趨向，突變株是否為耐藥株，突變株與野生株相對(duì)含量的變化與致病性的關(guān)系，突變株與免疫耐受的關(guān)系等均是有必要進(jìn)一步澄清的問題。
四、基因定量技術(shù)在HBV感染流行病學(xué)方面的應(yīng)用[16]。HBV經(jīng)血液傳播致病已十分明確，但是體液傳播的問題還必須有充足的證據(jù)來補(bǔ)充。體液及其它分泌液或排泄物傳播HBV是日常生活密切接后感染HBV的直接原因，但其中必然存在“含量與傳染性”的關(guān)系，那么這個(gè)致病的量值完全可以通過HBV感染流行病學(xué)研究得到確證。另外，被污染血制品中HBV基因含量與使用血制品后感染HBV的危險(xiǎn)性之間的關(guān)系也值得研究。
五、加強(qiáng)HBV低水平復(fù)制者預(yù)后研究。目前看來，所謂健康攜帶者或無癥狀帶病毒者、干擾素治療部分反應(yīng)者(partial responders),以及其他種種HBV在體內(nèi)呈低復(fù)制狀態(tài)者，在病情、機(jī)體免疫狀態(tài)、預(yù)后等方面可能都有一些特殊性，這類病人是否有自然清除病毒的傾向，是否應(yīng)當(dāng)實(shí)施抗病毒治療，是否成為重要的傳染源等問題都應(yīng)該作出符合實(shí)際的回答。
六、HBV復(fù)制水平與抗病毒藥物療效之間的關(guān)系研究有待深入。筆者認(rèn)為，HBV DNA水平與干擾素治療效果之間的所謂聯(lián)系在理論上缺乏根據(jù)，可能是一種表面現(xiàn)象，有必要探討其本質(zhì)。病毒復(fù)制水平高低取決于病毒自身的生物活性和機(jī)體的免疫功能，應(yīng)當(dāng)從病毒和機(jī)體兩方面尋找突破口，提高干擾素抗HBV的效果。
最后，在中國(guó)，有世界上為數(shù)最眾的HBV感染及相關(guān)慢性肝病患者，但我們?cè)贖BV感染診治研究方面仍處于落后狀態(tài)。就HBV定量技術(shù)而言，目前尚未建立分子雜交定量分析技術(shù)，現(xiàn)已報(bào)告的PCR定量分析法也屬于低水平重復(fù)，今后有必要重視這方面的投資和開發(fā)。在臨床研究領(lǐng)域應(yīng)當(dāng)有自己的立足點(diǎn)，不應(yīng)簡(jiǎn)單重復(fù)國(guó)外研究結(jié)果。就HBV DNA定量分析意義的研究而言，簡(jiǎn)單重復(fù)的現(xiàn)象已不鮮見，必須引以為戒。
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