- 相關推薦
談基因定位技術在遺傳病診斷中的應用
摘要： 熒光PCR定量技術(Quantitative PCR)是一種新興的基因定位技術。這項技術靈敏、簡便、快速、不需使用放射性同位素，PCR完成后，通過測序儀的自動識別即可對待測DNA進行定量分析。在遺傳病，特別是一些以大片段缺失為主要突變類型的遺傳病診斷中，熒光PCR定量技術發揮了很重要的作用。關鍵詞：熒光PCR定量技術；基因定位技術；遺傳病
在早期的遺傳學分子診斷中，主要依賴于Southern Blotting，寡核苷酸雜交等技術。自1985年Saiki等首次描述聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)以來，PCR技術因為其靈敏特異，省時省力等諸多優點而受到了人們的高度重視，已經應用于生物醫學和化學等基礎研究的各個領域，并且成為醫學臨床和法醫學研究的強有力分析工具之一[1-3]。然而，近幾年來，研究者們不再滿足于得知某一特異DNA序列的存在與否，他們更著眼于對其進行精確的核酸定量。盡管把PCR作為一種定量的工具，在技術上還面臨著一些挑戰。熒光PCR基因定位技術是近十余年來興起的一種分子生物學技術，與其他定量方法相比，具有靈敏、簡便、快速、不需使用放射性同
位素的特點，在基因表達、傳染病和遺傳病的診斷等方面迅速得到了廣泛應用。
1 熒光PCR基因定位技術的原理
熒光PCR定量技術的主要原理為：在PCR前，通過化學方法在引物的5’端通過共價方式連接一個熒光分子。由于在進行PCR時，引物和待擴增模板5’端的堿基不需要完全匹配，熒光PCR引物和普通PCR引物一樣，能夠對待測模板進行指數擴增。擴增完成后，根據PCR的產量，將熒光PCR產物直接或按一定比例稀釋后，和內標、載樣緩沖液混合，在自動測序儀上進行電泳。在自動測序儀內激光的激發下，PCR產物上的熒光分子發出固定波長的激發光，被儀器內的光電管捕獲。根據PCR產物從開始電泳到經過光電管的時間，測序儀自動計算出相應產物的實際堿基數。不同泳道之間電泳速度的差別，通過各產物內混合的內標校正。同時，測序儀也自動標出相應產物的熒光強度，該數值就是熒光PCR定量技術對模板進行定量與定位的基礎。與非定量PCR分析方法不同，熒光PCR的操作程序有助于評估污染的情況，即測出污染的程度，即使陰性對照產生了正的信號，只要這些信號比實驗樣品的低得多，依據這樣的結果，至少可以推測出實驗中所得出的信號是真實的[4-6]。在一定程度上，熒光PCR消除了普通PCR過于敏感、假陽性率高的缺點。熒光PCR常用于研究發病機制、估計病毒的負荷量、監測臨床治療進展或用于診斷遺傳缺陷等。通過對靶基因量的檢測，將其與疾病的臨床表現、臨床分型以及各種標志酶的值聯系起來，為疾病的診斷和藥物治療監測提供科學的依據。目前，該技術已廣泛應用于多種遺傳病的診斷和產前篩查，如地中海貧血、兒童型脊肌萎縮癥、杜氏/貝氏肌營養不良、胖骨肌萎縮癥和各種染色體病等。
2 熒光PCR基因定位技術在遺傳病診斷中的應用
2.1 在α地中海貧血中的診斷作用
1988年，Chehab用兩對引物同時擴增α珠蛋白和β珠蛋白基因，并在這兩對引物上分別標記上羅丹明和熒光素。在紫外線的照射下，羅丹明產生紅色熒光而熒光素產生綠色熒光。在同一循環條件下PCR完成后，通過離心將擴增產物和游離引物分離，根據擴增后產物顏色直接判斷基因的缺失情況[7]。如產物為桔紅色，則說明α和β珠蛋白基因都得了擴增。如果產物為綠色，說明α珠蛋白基因缺失，只有顯綠色熒光的β珠蛋白基因得到了擴增。
2.2 在DMD/BMD中的應用
DMD/BMD(杜氏/貝氏肌營養不良癥)是最常見的致死性神經肌肉遺傳病。在男性中，其患病率約為1/3 500，為x連鎖隱性遺傳，其中73%為缺失或重復突變，新生突變占所有患者的30%。由于x染色體的隨機失活比例不同，約40%的DMD攜帶者不能通過血清CPKH活性診斷。1992年，schwartz將熒光PCR應用于該病的攜帶者診斷。他們采用熒光引物和測序儀分析位于肌營養不良基因內部的4對CA重復序列。測序儀可以鑒別2個堿基對長度的差異，能夠為連鎖分析提供更多的信息[8]。在以下情況時，連鎖分析有時不足以對攜帶者進行判斷：①CA重復不能提供信息，②家族成員不全，③新生突變或者嵌合體造成的連鎖分析失效，因此，他們還采用熒光PCR直接擴增肌營養不良基因外顯子，并用測序儀定量分析產物，將結果和連鎖分析一起作為判斷攜帶者的依據。通過以上方法，他們對43名可疑攜帶者進行了診斷。
2.3 在PGD的應用
植入前診斷(PGD)只能獲得非常有限的模版，而熒光PCR比溴乙錠染色要敏感1 000倍，因此，熒光PCR在植入前診斷中的應用已經有較多的探索。等位基因失擴增(ADO)和污染是植入前診斷所面臨的兩個主要問題，因此PGD需要檢測致病基因和連鎖分析進行聯合判斷。但是限于取材，PGD只能提供一次PCR的模版。熒光PCR由于高靈敏度和分辨率，適合對少量模版進行多重PCR擴增，在一個體系中同時完成對疾病基因的檢測和連鎖分析。Joycec采用熒光多重PCR對6種遺傳�。簭娭毙约I養不良(DM)、囊性纖維(CF)、脆性X綜合征、神經纖維化2型和顱面成骨不全癥進行了植入前診斷。在進行PCR的過程中都同時擴增了一個多態位點，以確定被擴增細胞的來源以及排除污染[9]。對于顯性遺傳病，多態位點還能夠減少ADO可能帶來的誤診。在他們進行的研究中，對14次妊娠進行的植入前診斷都得到明確結論，其中13例進行了胚胎移植，另有1例沒有檢測到正常胚胎。
總之，PCR技術在定量與定位領域中的應用已經逐漸由實驗室中的探索發展成為理解復雜的生物本質的一項關鍵技術。毫無疑問，在不久的將來，熒光定量PCR技術將以其精確的定量，簡單迅速的操作，合理的成本，在分子生物學、實驗醫學，特別是臨床醫學領域中得到更加廣泛的應用。
[參考文獻]
[1]J.薩姆布魯克， D.W拉塞爾. 分子克隆實驗指南[M].3版. 北京：科學出版社， 2002： 488.
[2]彭志文，朱子平. PCR檢測乙肝DNA的注意事項[J].中國醫藥導報，2006，3（24）：147.
[3]魯軍.熒光定量PCR檢測乙肝病毒DNA的臨床意義[J].中國醫藥導報，2008，5（33）：78.
[4]劉煒，馬俊.FQ-PCR檢測沙眼衣原體及解脲支原體[J].中國現代醫生，2008，46（6）：139-140.
[5]羅燕春
【談基因定位技術在遺傳病診斷中的應用】相關文章：
談灌注樁在水利工程中的應用08-22
談建構主義在大學英語精讀課中的應用08-25
多媒體技術在鋼琴教學中應用論文04-28
談三維制作軟件在園林設計中的應用08-30
談智能決策支持系統及其在林業中的應用研究08-21
小學語文教學中多媒體技術的應用08-18
光網絡技術在城域傳送網中的應用08-08