淺談木犀草素對對乙酰氨基酚誘導的L02肝細胞損傷的保護作用
木犀草素，多以糖苷的形式存在于多種植物中，這些植物以全葉青蘭、辣椒、野菊花、金銀花、紫蘇含量較高。具有鎮咳和祛痰作用。據最新研究，呼吸道癥狀咳嗽、咳痰、喘息，均與氣道慢性炎癥有關。如支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、慢性咽炎、變應性鼻炎等引起咳嗽、咳痰、喘息，均被認為與局部的炎癥浸潤有關，炎癥的存在，使得氣道的免疫應答混亂，患者常出現氣道反應性增高。
[摘要] 探討木犀草素(luteolin，Lut)對對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)誘導的L02肝細胞損傷的保護作用。CCK8法檢測Lut對L02細胞活性的影響;篩選APAP誘導L02細胞損傷的濃度及作用時間;細胞形態學、CCK8實驗和流式細胞術檢測分析Lut對APAP誘導的L02細胞凋亡的影響;比色法檢測細胞上清液中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)活性;RTPCR檢測凋亡相關基因Bax，Bcl2，caspase3的表達。結果顯示Lut在2.5～40 μmol・L-1不影響L02細胞活性;12 mmol・L-1 APAP作用于L02細胞12 h可用于建立肝細胞損傷模型。與模型組相比，Lut組細胞狀態明顯改善，胞體增大，貼壁能力恢復明顯;細胞凋亡率明顯下降;MDA含量顯著下降(P<0.05或P<0.01)，GSH和SOD活性顯著提高(P<0.05或P<0.01)，同時能夠上調Bcl2及下調Bax，caspase3 mRNA的表達(P<0.05或P<0.01)。該實驗證明了Lut對APAP誘導的L02細胞損傷有保護作用，其機制可能與其減輕氧化應激反應和抑制細胞凋亡有關。
[關鍵詞] 木犀草素; L02細胞; 氧化應激; 細胞凋亡; 對乙酰氨基酚
對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是一種常見的解熱鎮痛藥，APAP在治療劑量下安全，但過量使用會造成急性肝損傷[1]。APAP過量服用在許多國家已成為故意或意外死亡的原因之一[23]。目前，有證據證實細胞內氧化應激是APAP引起急性肝損傷的重要生物學機制之一[47]，因此，探討能夠有效預防或緩解APAP引起的急性肝損傷途徑具有積極的臨床意義。
木犀草素(luteolin，Lut)屬于黃酮類化合物，主要存在于菊花、忍冬花、金銀花、紫蘇葉等植物中，近年研究表明木犀草素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調節等多種作用[811]。本文通過預防性給藥，研究給藥后氧化應激損傷相關生理指標變化，探討Lut的細胞保護和抗凋亡作用，為對乙酰氨基酚肝損傷的防治提供進一步的實驗依據。
一、材料
1.1 細胞 正常人肝細胞株(L02)為本實驗室保存。用含10%胎牛血清的DMEM完全培養基在37 ℃，5% CO2且飽和濕度條件下進行常規培養。
1.2 藥品與試劑 DMEM(高糖)培養基購自Hyclone公司;胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素均購自GIBCO公司;Cell Counting Kit8 (CCK8)購自東仁化學科技(上海)有限公司;木犀草素(luteolin，Lut)、五味子乙素(schizandrin B，Sch B)均購自成都普菲德生物技術有限公司;APAP購自中國食品藥品檢定研究院;AnnexinVFITC/PI試劑盒購自Sigma公司;谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;逆轉錄和PCR反應試劑盒購自Thermo Fisher Scienfitic公司;Bax，Bcl2，caspase3引物均購自Invitrogen公司。
1.3 儀器 酶標儀( BioTek Synergy H1 H1MFD，美國);DMIL HC型倒置相差顯微鏡(Leica，德國);流式細胞儀(BD FACS Canto Ⅱ)。
二、方法
2.1 細胞培養 L02細胞培養按照常規培養的方法，含10%胎牛血清、100 kU・L-1青霉素和100 g・L-1鏈霉素的DMEM(高糖)培養基，37 ℃，5% CO2培養箱培養。
2.2 CCK8檢測Lut對L02細胞活性的影響 將L02細胞以7×104個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，接種12 h細胞全部貼壁后，分別給予0，2.5，5，10，20，40，80，160 μmol・L-1的Lut，實驗設陰性對照孔和空白對照孔，每個濃度設3個復孔。在37 ℃，5% CO2的培養箱中培養8 h后CCK8檢測L02細胞的存活率。實驗重復3遍。細胞存活率=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%，式中Ac為對照孔吸光度，As為實驗孔吸光度，Ab為空白孔吸光度。
2.3 APAP誘導L02細胞肝損傷模型的建立 將濃度為7×104個/mL的L02細胞接種到96孔板，每孔100 μL，接種12 h細胞全部貼壁后，設0，6，12，18，24，30 mmol・L-1濃度梯度的.APAP進行造模，實驗設陰性對照孔和空白對照孔，每個濃度設3個復孔，分別在造模3，6，12，24，48 h后棄上清液，用CCK8檢測L02細胞的存活率。實驗重復3遍。
2.4 Lut對APAP誘導L02細胞損傷的影響 實驗分6組，分別是對照組、模型組(APAP，12 mmol・L-1)、3個實驗組(Lut，濃度分別為2.5，5，10 μmol・L-1)和陽性對照組(五味子乙素[12]，Sch B，5 μmol・L-1)。取對數生長期L02細胞，調整細胞數為7×104個/mL，接種于96孔板中，37 ℃，5% CO2培養箱中培養12 h，實驗組和陽性對照組更換為相應的含藥培養液，對照組和模型組更換新的完全培養液，繼續培養8 h后，除對照組外，其余各組加入APAP 12 mmol・L-1造模，造模12 h，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態后棄上清液，用CCK8檢測L02細胞的存活率。實驗重復3遍。
2.5 AnnexinV FITC/PI雙標記法檢測細胞凋亡 將L02細胞按照1×105個/mL 接種到6孔板中，每孔2 mL，分組、給藥及造模同2.4項，造模12 h后，將L02細胞消化下來，按照Annexin VFITC/PI說明書方法對細胞進行染色，利用流式細胞儀檢測L02細胞凋亡情況。
2.6 培養液MDA，GSH及SOD水平的檢測 將L02細胞按照1×105個/mL 接種到6孔板中，分組、給藥及造模同2.4項，造模12 h后收集細胞培養上清，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，檢測細胞培養上清中MDA含量、GSH及SOD活性。
2.7 RTPCR檢測Bcl2，Bax和caspase3 mRNA表達 分組、加藥及造模同2.2項。每組設3個復孔。造模12 h后收集細胞，應用Trizol試劑提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，以βactin為內參進行擴增，檢測細胞中Bcl2，Bax和caspase3 mRNA的表達量。Bcl2，Bax和caspase3 引物序列見表1。實驗操作按試劑盒說明書進行。
2.8 統計分析 所有數據均采用SPSS 17.0應用軟件進行統計學分析。計量資料數據用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。
三、結果
3.1 CCK8檢測Lut對L02細胞活性的影響 為了尋找合適的Lut反應濃度，本實驗考察了Lut(2.5，5，10，20，40，80，160 μmol・L-1) 對L02細胞活性的影響。研究發現Lut濃度在2.5，5，10 μmol・L-1時活性最強，故本實驗采用2.5，5，10 μmol・L-1的濃度梯度進行后續試驗，見圖1。
3.2 APAP誘導L02細胞損傷模型的建立 本研究首先考察APAP濃度和刺激時間對L02細胞損傷的影響，結果顯示隨著APAP濃度的增加，L02細胞的存活率逐漸降低;隨著造模時間的延長，相同APAP濃度下的L02細胞的存活率逐漸降低。綜合考慮造模時間和造模濃度，以IC50為原則，實驗中12 mmol・L-1APAP造模12 h的抑制率為(49.64±3.30)%，因此，本研究選擇造模時間為12 h和造模濃度為12 mmol・L-1的APAP進行后續試驗，見圖2。
3.3 Lut對APAP誘導L02細胞損傷的影響 形態學觀察發現，對照組細胞生長良好、背景清晰，細胞貼壁牢固，單個細胞呈扁平的梭形，透明度大、遮光性均勻;模型組(APAP，12 mmol・L-1)細胞出現明顯的凋亡，細胞數量減少，胞體縮小呈圓形。與模型組相比，Lut組和陽性藥五味子乙素(Sch B)中的細胞狀態明顯改善，貼壁能力恢復明顯，胞體增大，多數細胞呈梭形。從L02細胞形態變化上可見，Lut 在一定程度上可顯著減輕APAP的損傷作用，提高細胞存活率，表明Lut對APAP損傷的L02細胞具有一定的保護作用，見圖3。
CCK8檢測結果顯示，模型組中細胞存活率顯著降低(P<0.01)，約為對照組的50%，Lut組(2.5，5，10 μmol・L-1)和Sch B組細胞活力較模型組均有升高的趨勢(P<0.05或P<0.01)，尤以10 μmol・L-1 Lut組效果最為明顯，表明Lut對于APAP誘導的細胞損傷具有保護作用，這與細胞形態學結果一致，見圖3。
3.4 Lut 對L02細胞凋亡的影響 凋亡流式檢測結果顯示，與對照組相比，模型組(APAP，12 mmol・L-1)細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與模型組相比，Lut組(2.5，5，10 μmol・L-1)凋亡率顯著降低(P<0.05或P<0.01)，其中10 μmol・L-1Lut組效果最為明顯，見圖4。結果表明，Lut可顯著抑制APAP誘導的L02細胞凋亡。細胞凋亡率=早期細胞凋亡率+晚期細胞凋亡率。
3.5 木犀草素對APAP誘導的L02細胞中MDA，GSH及SOD的影響 實驗結果顯示，與對照組相比，APAP組MDA含量明顯升高，而GSH和SOD活性明顯降低(P<0.05或P<0.01);與模型組相比，不同濃度的Lut及Sch B可明顯降低MDA含量(P<0.05或P<0.01)，同時明顯提高GSH和SOD活性(P<0.05或P<0.01)，其中10 μmol・L-1 Lut組效果最為明顯，見表2。
3.6 Lut對凋亡相關基因Bcl2，Bax和caspase3表達的影響 實驗結果顯示，與對照組相比，APAP組Bax和caspase3 mRNA表達明顯升高(P<0.01)，同時Bcl2 mRNA表達明顯降低(P<0.01);與模型組相比，Lut組Bax和caspase3 mRNA表達明顯降低(P<0.05或P<0.01)，同時Bcl2 mRNA表達明顯升高(P<0.05或P<0.01)，尤以10 μmol・L-1Lut組效果最為明顯，提示Lut具有明顯的抑制L02細胞凋亡的作用，見表3。
四、討論
近年研究表明Lut具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調節等多種作用。本研究通過建立APAP誘導的肝損傷模型，探討Lut對APAP誘導的L02細胞損傷的保護作用。APAP 誘導建立的肝損傷模型是目前較為常用的肝損傷模型，此模型造模時間短、易復制、穩定性好，是篩選保肝藥物的理想模型[1315]。本實驗發現，APAP(12 mmol・L-1)能明顯抑制L02細胞活性，Lut干預后，與模型組比較，L02細胞活性明顯改善，其中10 μmol・L-1 Lut的藥效最為明顯。
氧化應激在APAP誘導的肝損傷中起著重要作用[16]。MDA是脂質過氧化反應的產物，其高低常�？梢苑从持|過氧化的程度，間接反映出細胞受自由基攻擊的嚴重程度。SOD是平衡機體氧化與抗氧化的關鍵酶，能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。SOD活性也是判斷細胞損傷程度的相關指標。GSH可直接通過供H+拮抗氧自由基毒性，清除體內的超氧離子及其他自由基，防止肝細胞損傷。GSH 是機體內最重要的非酶性抗氧化物，其水平的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素。因而本實驗測定三者水平來反映細胞氧化應激水平。本研究顯示，與模型組相比，Lut組氧化指標MDA含量明顯降低，抗氧化指標GSH和SOD活性則顯著提高(P<0.05或P<0.01)，研究初步表明木犀草素可通過減輕氧化應激反應而達到抑制APAP誘導的肝損傷。
氧化應激損傷可以引起細胞凋亡，本實驗中細胞形態觀察發現，與對照組相比，模型組細胞出現明顯的凋亡，細胞數量減少，胞體縮小呈圓形;而Lut組細胞狀態較模型組明顯改善，貼壁能力恢復明顯，胞體增大。CCK8檢測結果顯示，模型組中細胞存活率顯著降低(P<0.01)，而Lut組(2.5，5，10 μmol・L-1)的細胞活力較模型組均有升高的趨勢(P<0.05或P<0.01)，尤以10 μmol・L-1 Lut組效果最為明顯。凋亡流式結果表明，APAP可明顯誘導L02細胞凋亡，Lut預給藥后的各組細胞凋亡數量與模型組相比明顯減少(P<0.05或P<0.01)，以上結果表明Lut能夠抑制APAP誘導的細胞凋亡。
細胞凋亡是一種由多種基因參與調控的程序性死亡的過程，現已知多種基因與細胞凋亡的信號轉導相關，包括Bcl2家族基因(Bcl2，Bclxl，Bax，Bad等)，p53，Fas，FasL等都參與了凋亡的調控[17]。Bcl2家族基因能抑制或激活凋亡，其中Bax和Bad等基因可促進凋亡，而Bcl2和Bclxl等基因能抑制細胞凋亡[18]，Bax則通過抑制Bcl2的活性誘導細胞凋亡[19]。caspase3屬于半胱氨酸蛋白酶家族一員，在細胞凋亡中發揮重要作用。caspase3表達的增加、激活是外源性的死亡受體途徑和內源性的線粒體途徑凋亡信號通路共同的關鍵環節，因此是凋亡發生的標志酶[20]。RTPCR結果顯示，木犀草素是通過下調Bax和caspase3 mRNA及促進Bcl2 mRNA的表達而抑制APAP誘導的細胞凋亡。
綜上所述，木犀草素通過抑制氧化應激和細胞凋亡實現其對APAP誘導的L02細胞損傷的保護作用。其機制可能與抑制脂質過氧化，增強GSH和SOD活性，同時下調Bax和caspase3 mRNA及上調Bcl2 mRNA的表達有關，但詳細機制還有待進一步探討。
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