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      2. 抗生素微生物檢定及比濁法在效價測定中關鍵控制點

        時間:2024-08-11 17:23:18 碩士畢業論文 我要投稿
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        抗生素微生物檢定及比濁法在效價測定中關鍵控制點

          自1929年英國細菌學家弗來明發現了第1個抗生素一青霉素至今已有半個多世紀,隨著抗生素種類不斷增加,在治療感染性疾病和保障健康方面作出了令人矚目的貢獻。在當今世界醫學臨床上,抗生素類藥物已是一類不可缺少的重要化學藥物,在很多國家的醫藥T業中產值均居于首位。抗生素在農牧業上也被廣泛應用,隨著抗生素應用范圍的擴大,對抗生素藥品的分析工作更加繁重,現代化學分析技術不斷發展,特別是各種儀器分析和自動分析技術的日新月異,有可能對各種抗生素進行有效的快速測定,但傳統的生物檢測法及經典的化學分析方法還是目前各國藥典中采用最多、最主要的檢測方法。為保證抗生素藥品的安全有效性,對抗生素藥品的檢測及質量控制顯得尤為重要。
          抗生素微生物檢定法是國際上通用的經典測定法,由于微生物檢定法的特點是直觀和特異地反應抗生素藥品抗菌活性的差異,化學測定結果難于準確表征組分組成、含量和活性的關系,許多抗生素品種由于各種原因, 目前沒有適當的化學分析方法表征其活性,同時,微生物檢定法所需的儀器設備簡單,成本低廉,故抗生素微生物檢定法目前在各國藥典中仍占有重要地位。
          
          1 分類
          
          單組分抗生素由于結構明確,含量和生物活性相一致,采用化學分析方法測定含量是其發展趨勢,但對于慶大霉素、乙酰螺旋霉素和吉他霉素等多組分抗生素來說,各國藥典均采用微生物效價測定法。
          由于抗生素對微生物具有殺菌和抑菌作用,這是其他物理學或化學方法不能達到的,因此,用抗生素對細菌的抑制程度來檢定和表示效價是有實際意義的�?股匚⑸餀z定法可分為稀釋法、比濁法和管碟法。
          
          2 微生物比濁法測定原理及優點
          
          將不同質量濃度的標準品、供試品和接有試驗菌的液體培養基加入比色池中,經培養一定時間,約3~4 h,通過抗生素對細菌的抑制作用來觀察試驗菌生長混濁度,其混濁程度與細菌數的增加存在直接關系,當一定光束照射在混濁的液體培養基時,測定其透光率。
          采用抗生素比濁法測定抗生素,保證了濁度測定中的培養溫度、培養時間和測量結果的均一性,實現了在線檢測,并通過試驗材料的標準化和統一化,控制培養基和緩沖液的質量,可保證相對穩定的水平,降低抗生素微生物檢定的測定誤差,耗時短,出結果快速,降低可信限率,借助儀器檢測可同時測量3批樣品,減少人為因素。
          
          3 抗生素微生物檢定比濁法在效價測定中關鍵控制點
          
          3.1培養溫度的控制比濁法對溫度的要求較管碟法更加精確,管碟法的培養溫度要求(37±0.5)℃ ,而比濁法為(37±0.1)℃,對溫度的要求更加嚴格,在比濁法培養過程中,溫度的均一性控制非常重要,保證各點溫度的均勻是保證細菌正常生長的關鍵因素,也是試驗成功的重要因素。
          
          3.2儀器結構與比色池的排列采用的儀器型號為WBS一100微生物比濁法測定儀(北京先驅威鋒技術開發公司),其排降為拉丁方排列,可抵消培養過程中區域性的誤差,使分組更加明確,排除培養基加入時間先后的誤差。儀器中的感溫器必須正確放置,使溫度得到更好的控制。試驗中采用振搖培養,不致使細菌沉降于比色池底部,增加氧氣循環,有利于細菌生長。
          
          3. 3菌液的影響因素配制:取金黃色葡萄球菌CMCC(B)(26003)的第三代營養瓊脂斜面培養物,接種于營養瓊脂斜面上,35~37 cI=培養2O~22 h后,用0.9% 無菌氯化鈉注射液洗下菌苔備用。菌液應當天配制,當天使用。如采用冰箱放置第2天使用的菌液,此時菌液中的細菌開始老化,并部分死亡,所測出的數據不穩定,造成較大的誤差。
          
          3.4培養基成分及pH的影響細菌的生長速度,在沒有外加抑制物存在的情況下與培養基的成分、pH、培養溫度、通氣條件及細菌內在的繁殖能力有關。培養基的營養成分應能滿足細菌快速生長的需要,培養基的pH也是影響細菌生長的關鍵。一般情況下,pH偏低會導致金黃色葡萄球菌生長緩慢,使培養物濁度減少,誤差增大,pH過高也會導致結果偏離,所以,適宜培養基的pH滅菌后應在7~7.2。
          
          3.5比色池清潔度的影響測定用的比色池應采用硫酸一硝酸(95:5)浸泡,并用蒸餾水沖洗干凈�?股乇葷岱y量質量濃度一般為0.1~1 U/mL,而原始溶液質量濃度為1 000 U/mL。在稀釋過程中,所有試驗物品一定要清洗干凈,消毒滅菌,試驗中一旦污染會導致被污染管濁度異常或造成同質量濃度抗生素管結果差異明顯,可信限升高(可信限率(FL)%),可采用清水沖洗高質量濃度器具,采用專用洗刷池為宜,并與培養后的比色池或試管分開清洗,清洗時不得用毛刷,防止劃痕。
          
          3.6氣泡的影響因素待加人各種所需物質后,將比色池物質充分混勻,采用WBS一100微生物比濁法測定儀,可自動間歇振搖,振搖時不得產生氣泡,有氣泡則干擾測定結果,此點尤為重要。
          
          3.7微生物的污染(菌種不純)在配制菌懸液時所用器皿必須嚴格高壓滅菌,切忌使用未經滅菌的試管及物品進行試驗,防止造成原始菌液的污染。另外,菌液的不純也屬于微生物污染,表明正常試驗菌種被其他雜菌所污染,從而導致生物反應紊亂,導致細菌對抗生素的反應靈敏度降低,曲線不規則等現象。使精密度差,因此,在操作中要保持試驗環境清潔,嚴防污染微生物,一旦被污染,可重新開啟一支凍干菌種,從新傳代,致使試驗菌達到要求。
          
          3.8時間的一致性在加入標準品和供試品溶液及含試驗菌的培養基后,混合均勻,為防止培養基中的試驗菌提前生長,必要時將培養基放置2~4℃冷卻,適時取出加入菌液,此法可避免試驗時加注時間過長和加入先后不同而造成誤差,每個比色池的培養時間應一致。
          
          3.9抗生素微生物比濁法展望隨著抗生素微生物比濁法的出現,2012年獸藥典將收載約10個抗生素品種采用比濁法測定效價,這將大大減少耗時和提高檢測效率。隨著檢測技術的不斷提高,抗生素微生物檢定比濁法在菌液質量濃度和加菌量、抗生素質量濃度的稀釋范圍、培養基、緩沖液標準控制、培養時間、溫度、樣品和標準品質量濃度的制備、上機質量濃度范圍、全程試驗的環境條件及所用物品的滅菌要求,污物的處理等應制定出嚴格的規范和要求,是抗生素微生物檢定比濁法的發展方向。

        抗生素微生物檢定及比濁法在效價測定中關鍵控制點

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            抗生素微生物檢定及比濁法在效價測定中關鍵控制點

              自1929年英國細菌學家弗來明發現了第1個抗生素一青霉素至今已有半個多世紀,隨著抗生素種類不斷增加,在治療感染性疾病和保障健康方面作出了令人矚目的貢獻。在當今世界醫學臨床上,抗生素類藥物已是一類不可缺少的重要化學藥物,在很多國家的醫藥T業中產值均居于首位。抗生素在農牧業上也被廣泛應用,隨著抗生素應用范圍的擴大,對抗生素藥品的分析工作更加繁重,現代化學分析技術不斷發展,特別是各種儀器分析和自動分析技術的日新月異,有可能對各種抗生素進行有效的快速測定,但傳統的生物檢測法及經典的化學分析方法還是目前各國藥典中采用最多、最主要的檢測方法。為保證抗生素藥品的安全有效性,對抗生素藥品的檢測及質量控制顯得尤為重要。
              抗生素微生物檢定法是國際上通用的經典測定法,由于微生物檢定法的特點是直觀和特異地反應抗生素藥品抗菌活性的差異,化學測定結果難于準確表征組分組成、含量和活性的關系,許多抗生素品種由于各種原因, 目前沒有適當的化學分析方法表征其活性,同時,微生物檢定法所需的儀器設備簡單,成本低廉,故抗生素微生物檢定法目前在各國藥典中仍占有重要地位。
              
              1 分類
              
              單組分抗生素由于結構明確,含量和生物活性相一致,采用化學分析方法測定含量是其發展趨勢,但對于慶大霉素、乙酰螺旋霉素和吉他霉素等多組分抗生素來說,各國藥典均采用微生物效價測定法。
              由于抗生素對微生物具有殺菌和抑菌作用,這是其他物理學或化學方法不能達到的,因此,用抗生素對細菌的抑制程度來檢定和表示效價是有實際意義的�?股匚⑸餀z定法可分為稀釋法、比濁法和管碟法。
              
              2 微生物比濁法測定原理及優點
              
              將不同質量濃度的標準品、供試品和接有試驗菌的液體培養基加入比色池中,經培養一定時間,約3~4 h,通過抗生素對細菌的抑制作用來觀察試驗菌生長混濁度,其混濁程度與細菌數的增加存在直接關系,當一定光束照射在混濁的液體培養基時,測定其透光率。
              采用抗生素比濁法測定抗生素,保證了濁度測定中的培養溫度、培養時間和測量結果的均一性,實現了在線檢測,并通過試驗材料的標準化和統一化,控制培養基和緩沖液的質量,可保證相對穩定的水平,降低抗生素微生物檢定的測定誤差,耗時短,出結果快速,降低可信限率,借助儀器檢測可同時測量3批樣品,減少人為因素。
              
              3 抗生素微生物檢定比濁法在效價測定中關鍵控制點
              
              3.1培養溫度的控制比濁法對溫度的要求較管碟法更加精確,管碟法的培養溫度要求(37±0.5)℃ ,而比濁法為(37±0.1)℃,對溫度的要求更加嚴格,在比濁法培養過程中,溫度的均一性控制非常重要,保證各點溫度的均勻是保證細菌正常生長的關鍵因素,也是試驗成功的重要因素。
              
              3.2儀器結構與比色池的排列采用的儀器型號為WBS一100微生物比濁法測定儀(北京先驅威鋒技術開發公司),其排降為拉丁方排列,可抵消培養過程中區域性的誤差,使分組更加明確,排除培養基加入時間先后的誤差。儀器中的感溫器必須正確放置,使溫度得到更好的控制。試驗中采用振搖培養,不致使細菌沉降于比色池底部,增加氧氣循環,有利于細菌生長。
              
              3. 3菌液的影響因素配制:取金黃色葡萄球菌CMCC(B)(26003)的第三代營養瓊脂斜面培養物,接種于營養瓊脂斜面上,35~37 cI=培養2O~22 h后,用0.9% 無菌氯化鈉注射液洗下菌苔備用。菌液應當天配制,當天使用。如采用冰箱放置第2天使用的菌液,此時菌液中的細菌開始老化,并部分死亡,所測出的數據不穩定,造成較大的誤差。
              
              3.4培養基成分及pH的影響細菌的生長速度,在沒有外加抑制物存在的情況下與培養基的成分、pH、培養溫度、通氣條件及細菌內在的繁殖能力有關。培養基的營養成分應能滿足細菌快速生長的需要,培養基的pH也是影響細菌生長的關鍵。一般情況下,pH偏低會導致金黃色葡萄球菌生長緩慢,使培養物濁度減少,誤差增大,pH過高也會導致結果偏離,所以,適宜培養基的pH滅菌后應在7~7.2。
              
              3.5比色池清潔度的影響測定用的比色池應采用硫酸一硝酸(95:5)浸泡,并用蒸餾水沖洗干凈�?股乇葷岱y量質量濃度一般為0.1~1 U/mL,而原始溶液質量濃度為1 000 U/mL。在稀釋過程中,所有試驗物品一定要清洗干凈,消毒滅菌,試驗中一旦污染會導致被污染管濁度異常或造成同質量濃度抗生素管結果差異明顯,可信限升高(可信限率(FL)%),可采用清水沖洗高質量濃度器具,采用專用洗刷池為宜,并與培養后的比色池或試管分開清洗,清洗時不得用毛刷,防止劃痕。
              
              3.6氣泡的影響因素待加人各種所需物質后,將比色池物質充分混勻,采用WBS一100微生物比濁法測定儀,可自動間歇振搖,振搖時不得產生氣泡,有氣泡則干擾測定結果,此點尤為重要。
              
              3.7微生物的污染(菌種不純)在配制菌懸液時所用器皿必須嚴格高壓滅菌,切忌使用未經滅菌的試管及物品進行試驗,防止造成原始菌液的污染。另外,菌液的不純也屬于微生物污染,表明正常試驗菌種被其他雜菌所污染,從而導致生物反應紊亂,導致細菌對抗生素的反應靈敏度降低,曲線不規則等現象。使精密度差,因此,在操作中要保持試驗環境清潔,嚴防污染微生物,一旦被污染,可重新開啟一支凍干菌種,從新傳代,致使試驗菌達到要求。
              
              3.8時間的一致性在加入標準品和供試品溶液及含試驗菌的培養基后,混合均勻,為防止培養基中的試驗菌提前生長,必要時將培養基放置2~4℃冷卻,適時取出加入菌液,此法可避免試驗時加注時間過長和加入先后不同而造成誤差,每個比色池的培養時間應一致。
              
              3.9抗生素微生物比濁法展望隨著抗生素微生物比濁法的出現,2012年獸藥典將收載約10個抗生素品種采用比濁法測定效價,這將大大減少耗時和提高檢測效率。隨著檢測技術的不斷提高,抗生素微生物檢定比濁法在菌液質量濃度和加菌量、抗生素質量濃度的稀釋范圍、培養基、緩沖液標準控制、培養時間、溫度、樣品和標準品質量濃度的制備、上機質量濃度范圍、全程試驗的環境條件及所用物品的滅菌要求,污物的處理等應制定出嚴格的規范和要求,是抗生素微生物檢定比濁法的發展方向。

            抗生素微生物檢定及比濁法在效價測定中關鍵控制點

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