探討肺康飲含藥血清對人肺癌細胞
畢業論文研究表明，目前許多抗藥物的抗腫瘤作用可能是通過誘導腫瘤細胞凋亡實現的［4］。藥物對腫瘤治療的1個重要途徑就是誘導腫瘤細胞凋亡，傳統的益氣法和活血法在腫瘤的免疫治療中體現出較好療效［5］。肺康飲就是我們根據扶正祛邪的治療原則，在多年臨床實踐基礎上，采用益氣養陰、清熱解毒法研制而成的。經臨床觀察應用，對于中晚期非小細胞肺癌患者有1定療效，可降低化療對患者免疫功能的影響，改善患者的生活質量［2］。
最近10年來，肺癌的發病率逐年上升，盡管治療方法不斷改進，但5年生存率不足14%［1］。肺癌嚴重危害著人類身體健康，其發病率高，病死率高，目前臨床尚無理想的治療方法。臨床研究表明，中藥組方在治療肺癌方面取得了較好的療效，中醫藥是肺癌綜合治療的重要手段之1。肺康飲是由竹葉、桑葉等數味中藥組成的中藥復方，經臨床觀察對肺癌患者有1定的療效［2］，但作用機制還不清楚。為此，本研究采用中藥血清藥理學方法孵育人肺癌NC-H446細胞株，以細胞生長抑制率及凋亡率為觀察指標，以期深入探討肺康飲抗肺癌的作用機制。
1 材料與方法
1.1 人肺癌細胞系
人非小細胞肺癌NC-H446細胞株由中國醫科大學細胞室提供，我院實驗中心細胞室保存。
1.2 主要試劑
RPMI1640培養液、胎牛血清為GIBCO公司產品；噻唑藍（MTT）及2甲基亞砜（DMSO）為BBI公司產品； Annexin V細胞凋亡試劑（北京寶賽公司）。
1.3 主要儀器
美國SHELLAB2300型CO2細胞培養箱；日本Nikon倒置相差顯微鏡；美國Sfat自動酶標分析儀；美國FACScan流式細胞儀等。
1.4 實驗方法
1.4.1 肺康飲含藥血清的制備
肺康飲由竹葉、桑葉等數味中藥組成。傳統方法煎制，濃縮為100%。按照文獻方法［2］按成人用量定容為65mL/d計算，按成人65kg體重劑量的10倍灌胃，即每100g大鼠灌1mL藥汁，對照組給予相同劑量生理鹽水。給藥3d，末次給藥后1～2h無菌條件下自心臟取血，離心分離血清，56℃水浴，30min滅活，用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，-20℃保存備用。
1.4.2 分組與藥物血清添加
分為正常血清對照組，肺康飲低劑量（5%）血清組、肺康飲中劑量（10%）血清組、肺康飲高劑量（15%）血清組。參照文獻方法［2］制備藥物血清溫育液：①藥物血清組：臨用前將用藥組大鼠血清加入RPMI1640培養液，濃度分別為5%、10%、15%。②對照組：對照組大鼠血清加入RPMI1640培養液，濃度10%。
1.4.3 細胞培養
將NC-H446細胞株常規培養于含10%熱滅活小牛血清的RPMI1640培養液（含青鏈霉素各100IU/mL）中，于37℃、5% CO2培養箱內連續培養。
1.4.4 肺康飲含藥血清對NC-H446細胞增殖的影響
取對數生長期的NC-H446細胞株以1.50×106個/mL的細胞濃度接種于96孔培養板內，每孔體積200μL,在37℃、5% CO2培養箱內培養24h換液。采用直接加入法，分別加入不同濃度（5%、10% 、15%）的含藥血清和對照血清。每組設4個復孔。繼續培養24h、48h后，培養板每孔加入50μL MTT（2mg/mL），同樣條件繼續孵育4h，吸棄上清，每孔加入100μL2甲基啞砜（DMSO）振蕩混勻，于酶標492nm測定各孔的吸光度OD值，計算相應的細胞抑制率：
抑制率（%）=（1- OD實驗組/ OD對照組）×100%
1.4.5 肺康飲含藥血清誘導肺癌細胞凋亡表達的測定
將傳代的NC-H446細胞接種于100mL培養瓶中，以含10%熱滅活小牛血清的RPMI1640培養液置37℃、5%CO2孵育箱中培養；培養24h至對數生長期，棄培養液，分別加入含有不同濃度（5%、10%、15%）的含藥血清及對照組血清的培養液各4mL，置培養箱中培養48h。收集48h含藥血清培養的NC-H446細胞培養液，胰酶消化，PBS洗滌3次，置入10mL離心管中離心，4℃、1000rmp、10min，棄上清；加入70%乙醇4℃固定24h以上；上機前離心去除乙醇固定液，PBS清洗2次，加入100μL含鈣PBS靜置10min，加5μL Annexin V，10μL PI，避光反應15min，上機檢測，以不含藥血清處理的NC-H446細胞為陰性對照，計算相應陽性細胞表達率。
1.5 統計學方法
采用多因素方差分析法檢測組間差異的顯著性。所有統計學檢驗均應用SPSS11.5統計軟件進行。
2 結果
2.1 肺康飲含藥血清對NC-H446細胞增殖的影響
不同濃度的含藥血清分別作用于NC-H446細胞株，分別于24h、48h采用MTT法檢測各組血清對NC-H446細胞株增殖的抑制率。結果表明，各含藥血清組對NC-H446細胞的增殖均有抑制作用，抑制作用呈1定的量效和時效關系，即隨著含藥血清濃度的增加，抑制率逐漸增加；同時隨著作用時間的'延長，抑制率相應增加，見表1。表1 肺康飲含藥血清對NC-H446細胞增殖的影響（略 ）注：與同1時點對照血清組比較△ P<0.05,△△ P<0.01；與同組24h比較▲P<0.05
2.2 肺康飲含藥血清對NC-H446細胞凋亡的影響
不同濃度的含藥血清分別作用于NC-H446細胞株，分別于24h、48h，應用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。結果顯示：各含藥血清組均可誘導NC-H446細胞發生凋亡，與對照組間差異有顯著性，且誘導凋亡的作用具有1定的量效和時效關系，即隨著含藥血清濃度的增加，凋亡指數逐漸增加；同時隨著作用時間的延長，凋亡指數也相應增加，見表2。表2 肺康飲含藥血清培養24、48h后的細胞凋亡率（略 ） 注：與同1時點對照血清組比較△P<0.05,△△P<0.01；與同組24h比較▲P<0.05
3 討論
細胞凋亡是指在正常生理情況下，為了整個生物體的更大利益，受傷或衰老的細胞通過1種程序性細胞死亡方式犧牲自己的過程。凋亡作為細胞死亡的1種重要形式，對維持機體正常發展和保證體內平衡有著重要調節作用。細胞凋亡紊亂、細胞周期異常導致腫瘤無限制增殖是腫瘤發生的重要原因之1［3］。
研究表明，目前許多抗藥物的抗腫瘤作用可能是通過誘導腫瘤細胞凋亡實現的［4］。藥物對腫瘤治療的1個重要途徑就是誘導腫瘤細胞凋亡，傳統的益氣法和活血法在腫瘤的免疫治療中體現出較好療效［5］。肺康飲就是我們根據扶正祛邪的治療原則，在多年臨床實踐基礎上，采用益氣養陰、清熱解毒法研制而成的。經臨床觀察應用，對于中晚期非小細胞肺癌患者有1定療效，可降低化療對患者免疫功能的影響，改善患者的生活質量［2］。
在我們開展的實驗中，采用含藥血清培養腫瘤細胞，以人非小細胞肺癌NC-H446細胞為研究對象，以促進肺癌細胞凋亡為作用靶點，應用MTT法和流式細胞儀觀察肺康飲對NC-H446細胞的作用。發現肺康飲含藥血清能夠抑制肺癌細胞的增殖，MTT法顯示肺康飲含藥血清對腫瘤細胞的抑制作用呈時間和劑量依賴關系，即隨著含藥血清濃度的增加，抑制率逐漸增加；同時隨著作用時間的延長，抑制率相應增加。流式細胞儀檢測發現肺康飲含藥血清具有誘導NC-H446細胞株凋亡的作用，并隨著藥物劑量的增大和作用時間的延長，其作用愈明顯。由此可見肺康飲含藥血清可能是通過誘導腫瘤細胞凋亡而達到抑制其增殖的目的。但該方劑是否會影響細胞其它方面的改變，究竟是復方在起作用，還是其中的某種有效成分，尚有待于進1步研究。
【參考文獻】
1 Suh YA,Lee HY,Virmani A,et al.Loss of retinoic acid receptor Bete gene expression is linked to aberrant histone H3 acetylation in lung cancer cell linesd［J］.Cacer Res,2002,62(14):3945-3949
2 趙建清，李旺，張淑萍，等.肺康飲聯合化療治療晚期非小細胞肺癌臨床療效觀察［J］.中藥藥理與臨床，2006，22（5）：27
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