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小研殼聚糖-明膠三維支架的研究?氣道平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)
1 前言
在組織工程中，三維多孔支架為種植的細(xì)胞提供生物力學(xué)的支持，使細(xì)胞形成功能性的組織[1,2]。報告顯示，除了基底的化學(xué)性質(zhì)，支架的結(jié)構(gòu)體系對組織的培養(yǎng)起著重要作用。
近年來，多孔支架的構(gòu)建和發(fā)展在組織工程中的多種應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注[3-6]。
膠原是動物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，屬于不溶性纖維蛋白質(zhì)，遍布于體內(nèi)各種器官和組織，如皮膚、骨、軟骨、肌腱、角膜等等。明膠（Gelatin. Gel），是膠原的部分變性衍生物，無抗原性，生物相容性好，可生物降解[7]。
甲殼素是一種天然高分子化合物，屬于多糖。殼聚糖（Chitosan, CS）, 是甲殼素的脫乙�；a(chǎn)物，是細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖結(jié)構(gòu)類似物。殼聚糖是一種具有優(yōu)良生物相容性的可降解材料，其在哺乳動物體內(nèi)能被溶菌酶降解成氨基糖，氨基糖可以進(jìn)入糖胺聚糖和糖蛋白的代謝循環(huán)，也可以排除體外。它還具有低抗原性、促進(jìn)傷口愈合，抗菌等特性。此外殼聚糖是帶正電荷的線性多糖，它可與帶負(fù)電的生物大分子，如明膠形成聚電解質(zhì)配合物。殼聚糖還具有較好的力學(xué)性能，而且易于加工成型。綜合明膠和殼聚糖的優(yōu)點，將殼聚糖和明膠復(fù)合制備多孔支架材料, 將能滿足對支架材料的要求[8-10]。
目前，氣管組織工程研究的方法是在體外的支架材料上培養(yǎng)氣道平滑肌細(xì)胞(airwaysmooth muscle cell, ASMC )，形成有功能的組織。本實驗研究在不同條件下制備殼聚糖-明膠三維支架的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以及平滑肌細(xì)胞在支架中生長的狀態(tài)，為篩選可作為氣道組織工程研究用的材料奠定基礎(chǔ)。
2 材料和方法明
明 膠（ Sigma Chemical Co. ） ； 殼聚糖（HaiHui Bioengineering Co. ） ； 溶菌酶（7000u/mg,Biosharp,Japan）；戊二醛(分析純,成都科龍化工試劑)；醋酸（分析純，成都科龍化工試劑）；DMEM/F-12 培養(yǎng)基（Hyclone, USA）；胎牛血清(Sigma, USA)；培養(yǎng)用三蒸水；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板（Costar，USA）；MTT（Sigma, USA）；FITC-Phalloidin（Sigma,USA）。
2.1 制備三維殼聚糖-明膠支架
實驗選用的殼聚糖為精制殼聚糖。稱取一定量的殼聚糖用1wt%的醋酸，在室溫下溶解，然后在加入明膠（殼聚糖、明膠質(zhì)量按1：1 比例），使明膠、殼聚糖充分混合溶解，配制成濃度為1、2、3wt%的混合溶液。將混合溶液分裝到培養(yǎng)板，然后分別放入不同溫度（-20℃，-80℃，-196℃）下預(yù)凍。預(yù)凍24 小時后，放入冷凍干燥機(jī)凍干24 小時。然后對材料進(jìn)行（用0.25%戊二醛）交聯(lián)處理，用硼氫化鈉脫醛，用蒸餾水洗凈后，二次凍干，將材料放入干燥器備用。
2.2 結(jié)構(gòu)觀察
用掃描電子顯微鏡（SEM，TESCAN VEGA ?? LMU）對支架的架構(gòu)進(jìn)行觀察。在使用SEM 觀察支架之前，先用液氮冷凍支架的表面和部分使之?dāng)嗔?然后噴涂上金。支架孔的平均直徑作為支架的有效孔徑。隨機(jī)選擇每個樣品的三個不同區(qū)域，至少選擇20 個孔測量孔徑。
2.3 孔隙度的測量
我們采用液體轉(zhuǎn)化法來測量三維支架的孔隙度[11,12]。殼聚糖、明膠均不溶于正己烷，因此選用正己烷為轉(zhuǎn)換劑。正己烷能滲透進(jìn)入相互關(guān)聯(lián)的支架孔中，所產(chǎn)生的膨脹和皺褶可以忽略不計。測量時，首先將支架浸入裝有正己烷的量筒中5 分鐘，原正己烷的體積記為（V1）。
支架浸入量筒后，原正己烷和支架的總體積記為（V2）。取出支架后，剩余的正己烷體積記為（V3）。支架的孔隙度ε 可以通過以下公式獲得：ε（%）=（V1－V3）／(V2－V3) [13]。
2.4 大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)
本實驗采用組織貼塊法來制備大鼠氣道平滑肌原代細(xì)胞[14]。然后對原代細(xì)胞進(jìn)行傳代，使用第3 代的平滑肌細(xì)胞。所用培養(yǎng)基為DMEM/F-12 和10%胎牛血清。將細(xì)胞培養(yǎng)在37℃，5%CO2 的條件下，每三天換一次液。當(dāng)細(xì)胞爬滿培養(yǎng)瓶的80-90%時，可用于實驗。
2.5 細(xì)胞在殼聚糖-明膠三維支架中的增殖
將原代培養(yǎng)大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的第3 代，稀釋到細(xì)胞濃度為2×104 個/ml。在裝有三維支架的24 孔板中，每孔加入含有氣道平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)基500μl。培養(yǎng)到1、3、6d 分別用MTT 法檢驗細(xì)胞的活性。每孔加入100μlMTT（5mg/ml），在37℃，5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。吸去孔內(nèi)上清液，每孔加入500μl 二甲基亞砜（DMSO）溶解轉(zhuǎn)化的染料。再從每孔取出100μl 溶液轉(zhuǎn)移到96 孔板，用酶標(biāo)儀測定490nm 處溶液的OD 值[15]。
2.6 免疫熒光染色
將細(xì)胞種植于三維支架材料上以后，選擇適當(dāng)?shù)臅r間，對細(xì)胞骨架進(jìn)行染色。實驗步驟：
吸棄培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液；用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞2 次，每次10 分鐘；4%的多聚甲醛固定20 分鐘，用PBS 清洗細(xì)胞2 次；0.1%Triton X-100/PBS 室溫破膜5 分鐘，PBS 清洗細(xì)胞3 次；加入5ug/ml 的FITC-Phalloidin 室溫染色40 分鐘，避光過夜；用PBS 清洗細(xì)胞2 次；吸去多余水分，加熒光封片液（中性或偏堿性緩沖液加等量甘油）封片，用熒光顯微鏡(萊卡,CTR,6000)觀察[16,17]。
2.7 統(tǒng)計學(xué)方法
所有實驗都反復(fù)進(jìn)行4 次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示，n=4。組間數(shù)據(jù)采用χ2 分析，p<0.01 表示差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義；p<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。計算、統(tǒng)計軟件采用Originpro7.5 及ImageJ 1.4g program。
3 結(jié)果
3.1 預(yù)凍溫度和材料濃度對支架微結(jié)構(gòu)的影響
本研究制備的殼聚糖-明膠支架采用冷凍干燥法，冷凍干燥是先將物料凍結(jié)，然后在接近真空條件下升華逸出溶劑分子的一種干燥方法。該方法既能維持混合物在凍前的外形，又使其具有多孔海綿狀結(jié)構(gòu)。冷凍過程中在聚合物網(wǎng)絡(luò)中形成冰晶模版，在低于冰點的溫度下冷凍干燥，冰升華后形成多孔結(jié)構(gòu)。本研究以水作為致孔劑，通過控制冷凍溫度可調(diào)節(jié)冰晶大小，從而控制孔徑大小[18]。把殼聚糖-明膠混合材料以不同的濃度和預(yù)凍溫度制得支架。圖1 顯示出混合物在預(yù)凍溫度分別為-20℃、-80℃、-196℃，濃度為1 wt%，2 wt%，3wt%時，形成支架的形態(tài)。通過觀察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)預(yù)凍溫度為-20℃，混合物濃度為1wt%時，孔徑的最大范圍是在60-100μm。在相同的預(yù)凍溫度下，混合物的濃度為2wt%和3wt%，孔徑較小，分別為40-80μm 和35-50μm。類似的，我們可以觀察到預(yù)凍溫度越低，所得到的孔徑越小(表1)。在不同的預(yù)凍溫度下，隨著支架孔徑的大小變化，支架的孔隙度也在發(fā)生變化。當(dāng)支架的預(yù)凍溫度在-196℃時，其孔隙度高于預(yù)凍溫度在-20℃和-80℃的支架。
比較不同的預(yù)凍溫度，最高的孔隙度為93±0.6 %，其預(yù)凍溫度為-196℃。而同樣的預(yù)凍溫度下，濃度為2wt%和3wt%的支架的孔隙度降為90±0.6%和84±4.7%（表1）。在-20℃、-80℃的預(yù)凍溫度下，孔隙度有著同樣的變化趨勢，而相比于-196℃的預(yù)凍溫度，孔隙度都降低了，顯示出孔隙度取決于材料的預(yù)凍溫度和濃度。
凍干過程是在冰點以下使材料中冰晶升華，形成與原冰晶同樣尺度的孔徑。在較低的預(yù)凍溫度下，由于冷凍速度較快，形成數(shù)量較多和體積細(xì)小的冰晶，導(dǎo)致凍干材料孔徑較小，孔壁較薄，孔隙度較大。在預(yù)凍溫度較高時，冰晶可以不斷生長，形成數(shù)量較少和體積較大的晶體，導(dǎo)致凍干材料孔徑較大，孔壁較厚，孔隙度較小 [19]。而溶液的濃度直接影響溶液的粘度。當(dāng)溶液濃度較大即粘度較大時，不利于水和分子鏈的遷移，以至于形成的冰晶較小。
因此孔徑與溶液的濃度成反比[13]。
3.2 細(xì)胞在支架中的生長
通過掃描電鏡來觀察平滑肌細(xì)胞在材料上的生長。由圖2 可以看出，細(xì)胞接種到三維支架上以后，能貼附到支架上，在細(xì)胞數(shù)較少的情況下，細(xì)胞更趨向于沿著孔壁生長。多孔結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢在于為細(xì)胞提供了足夠的生長空間和更大的附著面積, 同時有利于營養(yǎng)成分的進(jìn)入和代謝產(chǎn)物的排出而不致引起細(xì)胞的生長抑制作用[20]。培養(yǎng)6 天的時間內(nèi)，細(xì)胞在支架上黏附生長良好，但細(xì)胞并未完全伸展。同時細(xì)胞沒有鋪滿孔壁，還較少向孔中生長。
3.3 MTT 檢測細(xì)胞增殖
通過MTT 實驗來測試氣道平滑肌細(xì)胞在材料中的細(xì)胞活性。細(xì)胞在材料中的生長受到多種因素的影響，包括表面結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等。把等量的細(xì)胞種植于支架中。由圖3 可見，隨著時間的增加OD 值也隨之增加，說明細(xì)胞在材料中生長良好。同時有圖3 可以看出，支架的微結(jié)構(gòu)對細(xì)胞的增殖情況有一定的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著支架孔徑以及孔隙度的增大，時間的延長， 細(xì)胞的增殖情況良好。而且孔隙度對細(xì)胞增殖的影響較為顯著（*p<0.01,**p<0.05）, 說明支架的孔徑對細(xì)胞的增殖起著重要的作用，然而支架的孔隙度在細(xì)胞增殖過程中起著更為顯著和決定性作用。
3.4 免疫熒光染色
FITC-Phalloidin 可特異的與真核細(xì)胞的filamentous actins 結(jié)合，從而顯示微絲骨架在細(xì)胞中的分布。通過FITC-Phalloidin 標(biāo)記細(xì)胞的filamentous actins 來觀察細(xì)胞的生長形態(tài)。FITC-Phalloidin 標(biāo)記細(xì)胞的filamentous actins 在熒光顯微鏡下呈綠色。由圖4，可以觀察到細(xì)胞在材料生長狀態(tài)良好，細(xì)胞呈現(xiàn)出各種形態(tài)，有放射狀，圓形，條形等。細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)清晰。
4 討論
眾所周知，細(xì)胞在三維支架中的存活和增殖受到支架的孔徑和孔隙度的影響。許多研究表明要在一定范圍增強(qiáng)細(xì)胞在支架中的存活、增殖，要么增加支架的孔徑，要么增加支架的孔隙度，或者同時增加孔徑和孔隙度的大小[21,22]。在本研究中，我們認(rèn)為孔隙度對細(xì)胞存活和增殖的影響不同于孔徑，孔隙度的改變對細(xì)胞在支架中的存活和增殖影響更為明顯。采用冷凍干燥法可以成功制備殼聚糖-明膠三維支架，支架的孔隙結(jié)構(gòu)取決于預(yù)凍過程中形成冰晶的數(shù)量和大小。在構(gòu)建三維支架時，我們可以通過改變預(yù)凍溫度和濃度，來調(diào)節(jié)支架的孔隙度與孔徑，從而改變支架的微結(jié)構(gòu)。由此，可以根據(jù)需要，來構(gòu)建合適的殼聚糖-明膠三維支架。同時，發(fā)現(xiàn)大鼠氣道平滑肌細(xì)胞在殼聚糖-明膠三維支架中生長時，支架的相對孔徑、孔隙度越大，細(xì)胞生長越好。
在組織工程的進(jìn)程中，發(fā)展一種適合細(xì)胞生長的材料是很重要的。材料的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)對形成有功能性的組織起著重要的作用。大鼠氣道平滑肌細(xì)胞在殼聚糖-明膠支架中的良好生長情況，顯示出支架的生物相容性和適合細(xì)胞生長的特性，殼聚糖-明膠支架顯示出了在組織工程領(lǐng)域良好的應(yīng)用前景。
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